Fijación y bloqueo de cultivos 2D de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para análisis inmunohistoquímico

Para comenzar, agregue 30 mililitros de hidróxido de potasio al 5% en metanol a un tubo de 50 mililitros. Incubar 100 cubreobjetos de 12 milímetros de diámetro en el tubo durante 30 minutos bajo agitación constante. A continuación, lave los cubreobjetos en agua desmineralizada durante 30 minutos.

Una vez finalizado el lavado, transfiera los cubreobjetos a una solución de isopropilo al 70% para su almacenamiento. Para recubrir los cubreobjetos, primero apóyelos individualmente contra la pared de una placa de Petri cuadrada. Cuando el alcohol isopropílico se haya evaporado, transfiéralos a una placa de 24 pocillos.

Pipetear un mililitro de colágeno en PBS en cada pocillo e incubar. A continuación, lave los cubreobjetos unas 4 o 5 veces durante cinco minutos cada uno con un mililitro de PBS. Pipetee los HUVC cultivados en los pocillos con los cubreobjetos recubiertos.

Después de cultivar las células durante el período de tiempo deseado, lave las células en un mililitro de PBS durante cinco minutos. Fije las células en un mililitro de paraformaldehído al 2% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Ahora, enjuague las células en un mililitro de PBS durante 3 a 4 ciclos de lavado de cinco minutos cada uno.

Finalmente, pipetee un mililitro de tampón de bloqueo en la placa del pocillo antes de teñir.