Para comenzar, agregue HUVEC en un tubo Falcon de 10 mililitros que contenga ocho mililitros de medio de crecimiento endotelial. Agregue dos mililitros de solución madre de METHOCEL en el tubo y agite bien. A continuación, transfiera 25 microlitros de la mezcla a la superficie interna invertida de una placa de Petri grande y cuadrada.
Gire suavemente la tapa 180 grados y colóquela en el fondo de un recipiente de cultivo celular e incube durante la noche. Al día siguiente, agregue 2,3 mililitros de colágeno de cola de rata tipo I a un vial que contenga 0,28 mililitros de 10X Medium 199. Mantenga esta mezcla en hielo y mezcle hasta que esté uniformemente amarilla.
Valora la mezcla contra el hidróxido de sodio hasta que se vuelva naranja. A continuación, añada 50 microlitros de tampón HEPES al producto final. Recoja las células cultivadas colgantes en un tubo Falcon de 50 mililitros con 20 mililitros de PBS, luego centrifuga.
Después de desechar el sobrenadante, agregue 0,1 mililitros de FBS y 0,4 mililitros de medio basal endotelial al pellet esferoide. Golpee suavemente el tubo para volver a suspender el pellet. Ahora, pipetee dos mililitros de solución madre de METHOCEL y mezcle bien.
Luego, agregue dos mililitros de la mezcla de colágeno preparada a los esferoides resuspendidos. Dispense 0,5 mililitros de la mezcla resultante en los pocillos de una placa de 24 pocillos e incube. A continuación, pipetee 100 microlitros de factor de crecimiento endotelial vascular humano recombinante diluido en los pocillos de la placa.
Incubar el cultivo celular a 37 grados centígrados bajo un 5% de suplementación de dióxido de carbono durante 12 horas. Al día siguiente, con un microscopio invertido, capture las imágenes de los esferoides que no están en contacto con el borde del pozo, entre sí, o muestran signos de daño. Los esferoides estimulados solo con medio basal o factor de crecimiento endotelial vascular humano recombinante fueron claramente distinguibles.
Los esferoides en geles de baja calidad parecían caer al suelo y dispersarse. El control negativo mostró una tasa de brotación basal moderada, mientras que el factor de crecimiento endotelial vascular humano duplicó o triplicó la longitud relativa de brotación. El número de brotes mostró un rango dinámico similar.
