Para comenzar, prepare seis medios de crecimiento de nematodos o placas de agar NGM. Al día siguiente, agregue 200 microlitros de cultivo de Escherichia coli OP50 en las placas e incube a temperatura ambiente durante un día. Después de la incubación, agregue 200 microlitros de D-glucosa 0.025 molar a cuatro placas de agar NGM y déjelas secar a temperatura ambiente.
Transfiera diferentes tres o cuatro trozos de Caenorhabditis elegans Bristol N2 de una placa de agar NGM de mantenimiento a una nueva placa NGM asentada con E. coli OP50. Incubar los gusanos C. elegans a 20 grados centígrados con una humedad superior al 95% durante tres días. Tres días después, agregue agua destilada en el plato y, con una pipeta Pasteur, recoja los gusanos.
Transfiera los gusanos recolectados a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y permita que se sedimenten por gravedad antes de eliminar el sobrenadante del tubo. Luego, agregue agua destilada en el tubo. Una vez que el volumen del tubo se reduzca a cinco mililitros, agregue 10 mililitros de solución blanqueadora y agite vigorosamente el tubo durante aproximadamente seis minutos.
A continuación, llene el tubo hasta una capacidad de 50 mililitros con tampón M9 y centrifugue a 1400 g durante tres minutos. Retire el sobrenadante hasta cinco mililitros y agregue 45 mililitros de tampón M9 en el tubo. Después del último lavado, retire el sobrenadante hasta la marca de 15 mililitros y transfiera el líquido restante a un plato.
Observe la placa bajo el microscopio para la liberación de huevos y coloque la placa a 20 grados centígrados con una humedad de más del 95% durante 14 horas. Después de la incubación, recoja los gusanos en un tubo de 15 mililitros. Con una pipeta automática, agregue 10 microlitros de los gusanos sincronizados a un portaobjetos de microscopio.
Cuente el número de gusanos y calcule el volumen requerido para obtener de 500 a 1000 gusanos por microlitro. Transfiera de 500 a 1000 gusanos sincronizados en etapa larvaria uno, o L1, a las placas de agar NGM. Previamente preparado y sembrado con E.coli OP50 y glucosa.
Incubar la placa a 20 grados centígrados hasta que los gusanos alcancen la etapa larvaria cuatro, o L4. Después de 48 horas, agregue tampón M9 en la placa y, con una pipeta Pasteur, recoja las larvas L4. Transfiera las larvas recolectadas a un tubo de 1,5 mililitros. Diseñar el cronograma de ensayos para tres grupos experimentales.
Transfiera aproximadamente 100 microlitros de suspensión de gusano de cada grupo al microtubo de 1,5 mililitros que contiene 400 microlitros de solución de yodo de Lugol al 5%. Agite suavemente el tubo en una batidora durante cinco minutos. Después de quitar el tubo de la batidora, espere a que los gusanos se sedimenten por gravedad.
Lave las lombrices tres veces con un mililitro de tampón M9. Después de volver a suspender los gusanos en 100 microlitros de tampón M9. Transfiera aproximadamente 50 microlitros al portaobjetos.
Coloque la funda en la corredera. A continuación, en un microscopio estereoscópico, seleccione el modo de campo claro y observe los gusanos. Guarde las imágenes que contengan un mínimo de 10 gusanos por grupo como un archivo jpeg.
Finalmente, calcule el contenido de glucógeno en función de la tinción de yodo de los gusanos. Las observaciones visuales del ensayo de contenido de glucógeno revelaron que los gusanos en ayunas mostraron una tinción más débil en comparación con los alimentados con E. coli OP50 y aquellos con E. coli OP50 y D-glucosa, que exhibieron la tinción más intensa.
