Para comenzar, prepare el tampón de lavado complementando la solución salina equilibrada de Hank con tampón de montones de 10 milimolares. Guarde el tampón a cuatro grados centígrados hasta su uso. Prepare el epitelio pigmentario de la retina o el medio RPE en DMEM y precaliente a 37 grados centígrados en un baño de agua.
Acueste al ratón sacrificado de lado con el ojo hacia arriba. Coloca el dedo índice sobre el ojo y el pulgar debajo. Aplique una presión suave sobre la estructura ósea alrededor del ojo para hacer que el globo ocular sobresalga.
Inserte la punta de las tijeras ligeramente abiertas debajo del ojo y gire suavemente la muñeca lejos del ojo 90 grados hasta que el ojo se desprenda de la cuenca. Coloque y enrolle inmediatamente el ojo en etanol al 70% durante cinco segundos. A continuación, transfiera el ojo a un tampón de lavado mantenido en hielo.
Bajo un microscopio de disección, coloque el ojo en una placa de Petri llena de tampón de lavado y tiras de gasa empapada. Estabilice el ojo sujetando el nervio óptico con pinzas y, con un bisturí, realice suavemente una incisión a nivel de la Ora Serrata. Inserte las tijeras Vannas en la incisión y corte alrededor de la circunferencia de la Ora Serrata hasta que se extirpen el segmento anterior y el vítreo.
Despegue suavemente la retina de la copa del ojo con pinzas atadas sin alterar la capa de EPR. Con la ayuda de unas tijeras, retire el nervio óptico y el exceso de tejido conectivo de la copa del ojo sin perforar la copa del ojo. Transfiera el ocular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de 0,25 % de tripsina y 0,02 % de EDTA.
incubar la copa ocular en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Cada dos minutos, retire el tubo y golpee firmemente la parte inferior 40 veces sobre la encimera. Después de la incubación, con la pipeta AP-1000, mezcle suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces para romper la copa del ojo.
Para neutralizar la tripsina, coloque inmediatamente las láminas de RPE desprendidas, excluyendo la copa ocular, sobre 0,5 mililitros de FBS en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, gota abajo, agregue medios de RPE a las capas de hojas de FBS y RPE para diluir la tripsina. Centrifugar el RPE a 340 G durante tres minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en una cantidad adecuada de medios RPE para una placa de 24 pocillos. Incubar el EPR a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante tres días. 24 horas después del aislamiento del EPR, las células pigmentadas nucleadas comienzan a asentarse sin una adherencia completa.
Durante las 48 a 72 horas, estas células se adhieren y se extienden, reteniendo la pigmentación oscura en un núcleo transparente. Después de cinco días, las células EPR muestran una mayor cofluidez al comenzar a formar contactos de célula a célula formando una monocapa polarizada con estructuras hexagonales. El EPR aislado mostró pureza como lo demuestra el marcador específico del EPR y la integridad de la unión estrecha después de seis días en cultivo.
