Antes de comenzar el aislamiento del embrión murino, limpie el área a fondo con etanol al 70%. Asegúrese de que todas las herramientas de disección estén lavadas y esterilizadas. Obtenga cinco mililitros de DMEM estéril que contenga un 10% de FBS y 20 mililitros de DPBS y colóquelos en hielo.
A continuación, para realizar el aislamiento embrionario, utilizando un microscopio estereoscópico con una etapa de luz transmitida y una cámara, coloque a la madre embarazada debidamente eutanasiada en su espalda y esterilice el área cercana a la abertura vaginal con etanol. Con unas tijeras de disección y unas pinzas, levante el pliegue de la piel cerca de la abertura vaginal y haga un pequeño corte en forma de V que revele lentamente el útero de la madre embarazada. A continuación, disecciona el cuerno uterino de la presa sujetando un extremo con unas pinzas y cortando a lo largo de él.
Asegurarse de extirpar el cuello uterino. Coloque el cuerno uterino en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga DPBS en hielo. Con tijeras de disección y pinzas, retire el músculo uterino a lo largo de los sitios de implantación y corte cada sitio de implantación o perlas que contengan las hinchazones deciduales en el interior.
Colóquelo en DPBS fresco en una placa de Petri de seis centímetros con hielo. Tomemos como ejemplo un sitio de implantación. Colóquelo en una nueva placa de Petri de seis centímetros encima de la platina del microscopio estereoscópico y agréguele 500 microlitros de DPBS.
Ajuste el enfoque del microscopio y la fuente de luz. Sostenga el sitio de implantación con un juego de pinzas en una mano y con la otra mano inserte lentamente otro par de pinzas en el extremo del sitio de implantación cortado del asta uterina, revelando gradualmente la hinchazón decidua. Para revelar el embrión, sostenga el extremo anti juicio erróneo de la hinchazón decidual aislada con un par de pinzas y con el otro par, haga lentamente un corte horizontal de aproximadamente un cuarto del tamaño de la hinchazón decidual desde el extremo del juicio erróneo.
Ahora, con ambas pinzas, empuje lentamente desde el extremo anti juicio erróneo de la hinchazón decidual hasta que el embrión salga del extremo del juicio erróneo recién cortado. Una vez que se revela el embrión, proceda a eliminar cualquier tejido embrionario adicional adherido. Si el saco endodérmico parietal y el cono ectoplacentario no se desprenden espontáneamente del embrión, use un par de pinzas para extraerlos junto con la sangre materna asociada.
Luego, mientras sostiene el embrión con un par de pinzas, retire lentamente el saco vitelino visceral del embrión con otro par de pinzas. Localiza el saco endodérmico parietal y el cono ectoplacentario. Con la pipeta AP 20, transfiera el saco vitelino con no más de 10 microlitros de DPBS de la placa a un tubo de PCR de ocho tiras con hielo.
Tome fotografías de campo claro de los embriones recién aislados para asegurarse de que la estadificación de los compañeros de camada sea similar. Con una pipeta P200, transfiera lentamente el embrión con 50 microlitros de DMEM que contiene un 10% de FBS a un tubo de 1,5 mililitros mantenido en hielo. Repita lo mismo para todas las hinchaduras deciduales, utilizando herramientas limpias y plásticos nuevos para cada aislamiento.
