Para comenzar, tome un plato de vidrio con una tapa hermética. Coloca una bola de algodón en el plato. Debajo de una campana extractora, agregue de tres a cinco mililitros de éter etílico a la bola de algodón.
Cubra inmediatamente el plato con la tapa. Use un pincel para recoger las larvas del tercer estadio de Drosophila de los viales de moscas. Transfiera una larva a un recipiente pequeño y abierto.
Coloque el recipiente en el plato de vidrio con éter etílico e inmediatamente cierre el plato herméticamente. Use un microscopio de disección para verificar la movilidad de la larva cada 30 segundos. Transfiera la larva anestesiada a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Sumerge las larvas en una gota de solución salina para insectos. Bajo el microscopio de disección. Retire la mayor parte de la solución salina con un pañuelo de papel.
Coloque el lado dorsal de la larva hacia arriba para la ablación de fibras gigantes, o el lado ventral hacia arriba para la ablación de TTMn. Luego, baje lentamente una cubierta de vidrio sobre la larva. Agregue solución salina al costado del cubreobjetos.
Para rellenar el espacio entre el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos. Para la ablación de fibras gigantes, verifique la posición del cerebro bajo un gran aumento en el microscopio de disección. Asegúrese de que el cerebro esté acostado al nivel y sea visible a través de la cutícula.
Para desplazar cualquier tejido graso que cubra el cerebro, use fórceps para aplicar una ligera presión al cubreobjetos y mueva el cubreobjetos de un lado a otro. Coloque la muestra en una platina de microscopio multifotónico. Utilice el filtro GFP para localizar la muestra en modo de epifluorescencia.
Para la ablación de fibra gigante, concéntrese en las células de interés y luego cambie al modo de dos fotones. Ajuste el láser a 870 nanómetros y ajuste la ganancia del detector para ver las células que expresan GFP con el escáner Galvano, defina el área para la ablación utilizando una región circular de interés. A continuación, proceda a configurar el protocolo de ablación en el software, para hacerlo, establezca secuencialmente un marco de adquisición, estimulación, seguido de otro marco de adquisición.
Inicie la potencia del láser de estimulación a un valor más bajo y ejecute el protocolo de estimulación. Si la ablación no fue exitosa y solo blanqueó la célula, aumente la potencia del láser en incrementos del 5% o el número de bucles de uno en uno, y vuelva a ejecutar el protocolo. Haga esto hasta que se vea una ablación celular exitosa.
Después de ablacionar con éxito la célula, retire el cubreobjetos. Con un pincel, recoja suavemente las larvas del portaobjetos y luego transfiéralas a un frasco de comida. En muestras gigantes de ablación de fibras.
La ablación se verificó a través de la ausencia de un soma marcado con GFP en el lado ablacionado del cerebro. Para las larvas ablacionadas con TTMn. La ausencia de TTMn en un lado se reconoció fácilmente debido a la falta de soma y dendritas.
