Para empezar, en una campana de cultivo celular, agregue el lipoaspirado cosechado en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Transfiera el lipoaspirado a una jeringa estéril Luer lock de 20 mililitros. A continuación, conecte un conector de 1,4 milímetros a la jeringa.
Ahora conecte una segunda jeringa Luer lock de 20 mililitros en el lado contralateral del conector. Empuje el tejido adiposo de una jeringa a la otra unas 30 veces. Luego transfiera la grasa emulsionada a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mililitros.
Centrifugar la grasa a 500 g durante 10 minutos. Luego desecha la capa superior aceitosa. Recoja la capa central purificada que contiene la capa vascular estromal separada y transfiérala a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mililitros.
Ahora llene el tubo de centrífuga con DMEM suplementado hasta la marca de 40 mililitros. Vuelva a centrifugar el tubo a 500 g durante cinco minutos. Recoja la capa mSVF resultante y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros.
En un tubo estéril de 1,5 mililitros, pipetear 100 microlitros de la fracción vascular estromal aislada. A esto, agregue 10 microlitros de trombina, luego pipetee 10 microlitros de cloruro de calcio. Por último, añade 70 microlitros de ácido tranexámico a la mezcla.
Con una punta de pipeta nueva, añada 10 microlitros de fibrinógeno al tubo poco antes de la aplicación. Después de la polimerización de la mezcla de hidrogel mSVF, pipetee 200 microlitros del hidrogel en una placa de 12 pocillos con fines analíticos. Ahora agregue 100 microlitros del hidrogel de fibrina en un pocillo como control negativo.
Incube la placa de 12 pocillos a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, añada un mililitro de medio de cultivo precalentado a cada pocillo. Vuelva a colocar la placa de 12 pocillos en la incubadora durante cuatro horas.
Añadir un mililitro de resazurina a cada pocillo antes de volver a incubar durante 24 horas. Pipetee las muestras de resazurina en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, utilice un lector de microplacas multimodo de imágenes celulares para medir la primera intensidad de fluorescencia.
Para el análisis histológico en los días uno, tres y siete, incubar el hidrogel de fibrina en 0,5 mililitros de paraformaldehído al 4%. Ahora agregue 1% de PBS al plato y guárdelo a cuatro grados centígrados. Se realizó el ensayo de resazurina para cuantificar la viabilidad celular in vitro de la fracción vascular y del hidrogel.
La fracción vascular mostró una viabilidad reducida al tercer día, mientras que la combinación de mSVF-hidrogel de fibrina se mantuvo cerca del valor basal. Al séptimo día, la viabilidad de la mSVF disminuyó, mientras que la combinación de mSVF-hidrogel de fibrina aumentó. El análisis histológico no mostró una reducción en el número de núcleos celulares en los días tres y siete.
El hidrogel de fibrina mostró una degradación mínima con grupos de células visibles distribuidos uniformemente.
