Para comenzar, tome imágenes de las secciones de tejido endometrial después de la tinción con los anticuerpos adecuados. Para importar imágenes multiespectrales, vaya a Archivo y luego a Abrir imagen en la interfaz del software. Haga clic en Seleccionar fluoróforos y elija la biblioteca espectral adecuada para desmezclar los fluoróforos y haga clic en Aceptar para confirmar.
Aísle el espectro de autofluorescencia con la herramienta cuentagotas de AF para muestrear un área de tejido representativa de la imagen de AF y etiquete los cuatro marcadores de superficie celular y asigne colores específicos para su identificación. Haga clic en Preparar imagen o Preparar todo para finalizar la preparación. Para la segmentación de tejidos, delinee manualmente de tres a cinco regiones por tipo de tejido, incluidas las áreas epiteliales, estromales y en blanco.
Ajuste las regiones y los parámetros según sea necesario para mejorar el conjunto de datos de entrenamiento, lo que mejora la precisión del software en la identificación de estructuras de tejidos. En Células de segmento, seleccione Núcleos y membrana. Elija DAPI para identificar los núcleos celulares y ajustar la configuración de intensidad para detectar todos los núcleos celulares sin ruido de fondo.
Seleccione las señales CD16, CD49A y CD56 para encontrar la membrana y ayudar en la división nuclear. Utilice la función de división de componentes nucleares para distinguir núcleos muy cercanos. En el esquema de fenotipado, adopte los marcadores CD56, CD49A, CXCR4 y CD16 para el fenotipado celular.
Utilice el botón Agregar para clasificar las celdas como que expresan positiva o negativamente cada marcador. Etiquete manualmente al menos cinco celdas para cada fenotipo durante el proceso de entrenamiento. Después de configurar el fenotipado de células, el software indicará la expresión de los marcadores de superficie para cada célula.
Exporte los datos a una hoja de cálculo para su posterior análisis. La novedosa estrategia de clasificación identificó cuatro subtipos de células NK en función de la expresión de CD49A y CXCR4.
