Preparación de muestras de sangre total para citometría de flujo y análisis de citocinas para determinar la inmunidad del huésped específico del antígeno a patógenos fúngicos y virales

Para comenzar la preparación de la muestra para la citometría de flujo, extraiga de la incubadora los tubos de estimulación que contienen muestras de sangre completa con Brefeldina A. Añada 500 microlitros de solución de EDTA 0,5 molar a cada tubo de estimulación que contenga Brefeldina A. Transfiera las muestras a nuevos tubos de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, pipetee un mililitro de tampón de lisis eritrocitaria en cada tubo de estimulación para enjuagarlo.

Transfiera el tampón y la suspensión de la celda al mismo tubo de centrífuga. Centrifugar los tubos a 600 g durante siete minutos y pipetear cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, añada el tampón de lisis eritrocitaria al pellet y vuelva a suspenderlo.

Incubar las muestras a temperatura ambiente hasta que las muestras parezcan claras o durante un máximo de seis minutos. Centrifugar los tubos a 600 g durante siete minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue un mililitro de HBSS al pellet.

Transfiera la suspensión celular a tubos de reacción de dos mililitros. A continuación, centrifugar los tubos a 400 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante antes de realizar la tinción por citometría de flujo.

Transfiera las muestras de los tubos de estimulación que no contienen Brefeldina A a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 2.000 g durante 20 minutos. Ahora pipetee con cuidado el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

Si no se analiza el sobrenadante inmediatamente, criopreserva la muestra a 80 grados centígrados. Cuando se utilicen muestras congeladas, la centrífuga descongelará los sobrenadantes de nuevo a una velocidad superior a 7.000 g durante cinco minutos antes del análisis. Realice la predilución de las muestras según lo requerido por el protocolo de ensayo de citocinas.

Vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de tampón de protección de ARN. Criopreservarlo a 80 grados centígrados para su posterior aislamiento de ARN. Alternativamente, vuelva a suspender el pellet celular en 700 microlitros de tampón de lisis para el aislamiento inmediato del ARN.