Para empezar, toma ojos de cerdo colocados en un vaso de precipitados de un litro. Sostenga un globo ocular con pinzas y retire los tejidos oculares adicionales con unas tijeras en una placa de Petri estéril. Para las heridas del epitelio, sostenga el globo ocular con toallitas esterilizadas sin pelusa y marque el centro de la córnea con una trépano de seis milímetros.
Luego, con un bisturí pequeño o una hoja de afeitar suave sin filo, raspe suavemente las células epiteliales dentro del círculo marcado con trépano. Elimine todos los desechos celulares mientras se asegura de que la membrana basal permanezca intacta. Después, limpie el área de la herida con hisopos de algodón.
Con un bisturí y unas tijeras, diseccione el globo ocular cortando a lo largo de los bordes córneo-esclerales. A continuación, enjuague las córneas en un vaso de precipitados esterilizado de 500 mililitros que contenga PBS. A continuación, coloque las córneas extirpadas boca abajo en un molde estéril.
Llene la cavidad corneal endotelial con un medio esencial mínimo, o MEM, que contenga 1% de agarosa mantenida a 48 grados centígrados. Ahora, invierte y transfiere las córneas a una placa de 35 milímetros. Agregue dos mililitros de MEM con o sin el agente de prueba gota a gota en la superficie de la córnea central, asegurando que la región de la conjuntiva limbal esté cubierta mientras deja el epitelio expuesto al aire.
A continuación, coloque las placas de cultivo en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. A las 40 horas después de la herida, tiñe las córneas cultivadas heridas con solución de tinción Richardson. Lave las córneas manchadas con PBS antes de fotografiarlas.
A continuación, utiliza una trépano del mismo tamaño para marcar la herida original y, con un pequeño bisturí, raspa las células epiteliales dentro de los círculos marcados. Retire las células recolectadas y transfiéralas a un tubo de centrífuga preenfriado. El área restante de la herida fue significativamente mayor en las córneas tratadas con nepafenaco al 0,1% en comparación con las tratadas con bromfenaco al 0,09% y ketorolaco al 0,45%Las córneas tratadas con LL-37 a 0,2 y 0,5 microgramos por mililitro mostraron una cicatrización significativamente acelerada de la herida en condiciones de alta glucosa en comparación con las córneas no tratadas.
