Para empezar, coloque las imágenes de ojos de mosca Drosophila sanas y degeneradas en la misma carpeta. Asegúrese de que los archivos tengan un nombre adecuado para identificar los grupos experimentales y distinguir entre machos y hembras. Abra el software Ilastik.
Haga clic en Crear nuevo proyecto. A continuación, en Otros flujos de trabajo, seleccione Recuento de densidad de celdas y seleccione una ubicación para guardar el archivo del proyecto. Secuencialmente, haga clic en 1.
Ingrese datos, Agregar nuevo y Agregar imágenes separadas para elegir la imagen estándar. A continuación, haga clic en 2. Selección de características y seleccione las características.
Elija más valores sigma para aumentar la sensibilidad. Haga clic en 3. Contando y establezca el valor sigma en primer plano en 5,00.
Con la herramienta de primer plano, marque 50 o más omatidios individuales en la imagen estándar. Haga clic en 3. Contando de nuevo y use la herramienta de fondo para marcar el área fuera de los omatidios.
Dibuja líneas verdes en forma de celosía alrededor de los omatidios. Haga clic en 4. Densidad Exportar y elija Exportar configuración de imagen para ajustar la configuración de la imagen.
A continuación, haga clic en Información del archivo de salida y seleccione el formato tiff para un análisis más detallado en Flynotyper. Haga clic en 5. Procesamiento por lotes, seleccione Archivos de datos sin procesar y seleccione todas las fotos de moscas experimentales que se analizarán .
La lista de imágenes importadas que se van a analizar se ve en Seleccionar archivos de datos sin procesar. Haga clic en Procesar todos los archivos en la parte inferior de la 5. Sección de Procesamiento de Lotes.
Una vez que el software complete el procesamiento, verifique la carpeta que contiene las imágenes experimentales de ojo de mosca. Confirme que las imágenes negras nombradas, las probabilidades del nombre de la muestra, están presentes. En ImageJ, abra el archivo tiff generado por Ilastik.
Usa la herramienta de selección de rectángulo para hacer un rectángulo alrededor del ojo. Seleccione Control X o Control C para recortar el área y espere a que aparezca un cuadro negro con la forma del contorno del rectángulo. Secuencialmente, haga clic en Archivo, Nuevo y Portapapeles interno para abrir el ojo de mosca recortado.
Para guardar el ojo de mosca cortado como JPEG, haga clic en Archivo, Guardar como y JPEG. En ImageJ, haga clic en Plugins y Flynotyper. En Genotipos, seleccione Agregar genotipos y abra la carpeta que contiene las imágenes de ojo de mosca cortadas.
Marque las casillas Microscopio óptico y Verticalmente. Luego, en Clasificar Ommatidia Por, marque las casillas Estabilidad y Distancia al centro. Para el número de omatidios clasificados considerados, establezca la entrada como 200.
Haga clic en Ejecutar y espere a que aparezcan los resultados del análisis. Copie y pegue el archivo de muestra y la puntuación P en el software estadístico para su posterior análisis. Las imágenes oculares de Drosophila procesadas con Ilastik y analizadas bajo luz anular mostraron patrones omatidiales más claros en comparación con aquellas sin luz anular, lo que mejora la evaluación cualitativa.
El análisis de Flynotyper indicó puntuaciones fenotípicas significativamente más altas en los ojos de mosca moderada y severamente degenerados en comparación con los ojos no degenerados. Cuando no se utilizó Ilassik, las puntuaciones P entre los ojos no degenerados y los moderadamente degenerados fueron similares.
