Para empezar, prepare una cámara humidificada tomando una caja deslizante grande y quitando la tapa de cartón adherida a la tapa. Coloque las toallas de papel húmedas verticalmente en la base de la caja deslizante, asegurándose de que queden planas. Prepare el portaobjetos para la tinción mediante desparafinación, rehidratación, recuperación de antígenos y lavado.
Retire el portaobjetos del PBS y limpie el exceso de PBS evitando el pañuelo. Con un bolígrafo hidrofóbico, dibuja un cuadro alrededor del pañuelo para formar una barrera. Coloque la corredera de contorno horizontalmente sobre las toallas de papel húmedas.
Agregue aproximadamente 100 microlitros de tampón de bloqueo para cubrir el tejido. Cierre la cámara humidificada e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 90 minutos. Luego, golpea suavemente la solución de bloqueo.
Agregue inmediatamente el bloque de ratón contra ratón preparado para cubrir el tejido e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Al final de la incubación, retire los portaobjetos de la cámara humidificada y colóquelos directamente en una rejilla de portaobjetos sumergida en PBS. A continuación, retire las diapositivas de PBS.
Retire suavemente el exceso de PBS y colóquelos horizontalmente de nuevo en la cámara humidificada. Agregue anticuerpos primarios de interés adecuadamente diluidos para cubrir el tejido. Una vez que los portaobjetos se hayan retirado de la cámara humidificada, golpee suavemente los anticuerpos primarios y colóquelos en una rejilla de portaobjetos sumergida en PBS durante cinco minutos.
Después de retirar los portaobjetos del PBS y eliminar el exceso de PBS, colóquelos horizontalmente de nuevo en la cámara humidificada. Agregue fluoróforos de anticuerpos secundarios adecuadamente diluidos o anticuerpos primarios conjugados de interés para cubrir el tejido. A continuación, añada Huist adecuadamente diluido directamente sobre el tejido antes de incubar a temperatura ambiente en la oscuridad.
Después de eso, coloque los portaobjetos en un nuevo plato resistente a los solventes lleno de PBS durante cinco minutos en la oscuridad. Retire una diapositiva a la vez, manteniendo las diapositivas restantes sumergidas en PBS en la oscuridad. Después de eliminar el exceso de PBS, agregue una o dos gotas de medio de montaje antidecoloración en el centro del tejido.
Sostenga un cubreobjetos limpio por los bordes y bájelo lentamente sobre la corredera en un ángulo de 45 grados. Comenzando en el centro del pañuelo, presione suavemente el cubreobjetos con dos dedos. Coloque una pipeta P200 cortada y sin filtrar en la punta de una pipeta serológica conectada a una aspiradora.
Siguiendo los bordes del cubreobjetos, utilice la aspiradora para eliminar el exceso de medio de montaje. En una caja de portaobjetos nueva, coloque horizontalmente el portaobjetos plano antes de dejarlo secar en la oscuridad a temperatura ambiente. Las imágenes microscópicas mostraron la morfología de los diferentes segmentos intestinales y la tinción de las células caliciformes.
La membrana apical, la membrana lateral de las células epiteliales y los núcleos. La tinción inmunofluorescente del intestino puso de manifiesto muchos compartimentos celulares diferentes, como las células proliferativas, el intersticio, el dominio lisosomal y el epitelio.
