Para preparar cilindros de un centímetro de largo y un centímetro de diámetro, caliente un cortador de cartón bajo la llama de un mechero Bunsen y corte un tubo de 15 mililitros con la cuchilla calentada. Cubra un lado de los cilindros con piezas de Parafilm. Después de anestesiar al ajolote y asegurarse de que no responde a los estímulos táctiles, oriente la extremidad perpendicular al eje del cuerpo.
Amputar la extremidad inmediatamente distal a la zona calcificada de la región zeugopodio. Regrese el ajolote a un tanque que contenga agua fresca de retención con analgésicos. Después de 24 horas, transfiera el ajolote de nuevo al agua de retención fresca y permita que la extremidad se regenere hasta la etapa deseada de interés.
Después de colocar el ajolote anestesiado bajo un microscopio estereoscópico, mida la longitud de la extremidad en la etapa deseada de regeneración para las etapas de histólisis y condensación del cartílago. Después de recolectar las extremidades, colóquelas en una placa de Petri para su disección. Bajo un microscopio estereoscópico, diseccione las extremidades con un bisturí a la altura del codo y colóquelas en una placa de Petri que contenga una solución de APBS.
Coloque las pipetas Pasteur y el termobloque a 37 grados centígrados con alícuotas de agarosa en la plataforma de trabajo. Retire el bloque frío del congelador a menos 20 grados centígrados y coloque el cilindro con el extremo cubierto de Parafilm hacia abajo encima. Coloque la extremidad en un plato limpio y retire suavemente el exceso de líquido de la extremidad diseccionada con papel de seda.
Agregue la agarosa derretida de bajo punto de fusión en la parte superior y mueva brevemente la extremidad alrededor de la agarosa para desplazar cualquier APBS restante de la superficie de la piel. Coloque rápidamente la extremidad dentro del cilindro, asegurándose de que esté orientada verticalmente con el área de interés hacia arriba. Agregue agarosa de bajo punto de fusión dentro del cilindro hasta que el tejido esté completamente cubierto.
A continuación, retire el cilindro del bloque frío y deje que la agarosa se solidifique durante 30 segundos. Después de la solidificación, retire el Parafilm de la parte inferior del cilindro y fije el tejido que contiene agarosa a la etapa de vibratomo con pegamento de cianoacrilato. A continuación, retira el exceso de agarosa circundante con un bisturí.
Sumerja la etapa en la solución APBS para seccionar. Comience a seccionar la agarosa en pasos de 100 micrómetros hasta llegar a la punta del tejido. Luego, corte hasta que se extirpe la porción distal de tejido.
Con una cuchilla de afeitar, retire con cuidado el bloque de agarosa que contiene tejido de la etapa de vibratomo. Inmediatamente, fije el bloque a una placa de Petri de plástico de 35 milímetros con pegamento adhesivo para tejido quirúrgico. Agregue aproximadamente dos mililitros de medio de cultivo para cubrir el tejido.
