Antes de realizar mediciones de microscopía de fuerza atómica o AFM, monte el voladizo en un bloque de vidrio. Inserte una placa de Petri llena de PBS en el soporte de la etapa del motor e inserte el bloque de vidrio en la cabeza del AFM. A continuación, coloque el cabezal AFM sobre la placa de Petri de modo que el voladizo quede sumergido en el tampón y alinee el láser manualmente.
En el software JPK, presione el botón de aproximación y adquisición para avanzar el voladizo sobre una superficie dura. Una vez adquirida la curva de fuerza-distancia única, abra el administrador de calibración y, en método, seleccione basado en contacto. A continuación, ajuste la temperatura ambiente a 20 grados centígrados.
Ahora acérquese a la curva y seleccione la parte lineal para el ajuste de sensibilidad. Haga clic en la casilla de verificación de sensibilidad y retraiga el voladizo a 200 micrómetros de la superficie. A continuación, seleccione la casilla de verificación del símbolo de infinito y haga clic en Ejecutar ruido térmico.
A continuación, amplíe el gráfico de frecuencia resultante y defina un rango con el botón derecho del ratón. Seleccione la casilla de verificación Constante de resorte y cierre el administrador de calibración. Inserte la placa de Petri que contiene la extremidad de ajolote regenerada incrustada en el bloque de tejido y el medio de cultivo en el soporte de la placa del AFM.
Adquiera una imagen general del bloque de tejido en modo de campo claro. Acérquese a la región de interés y ajuste el tiempo de exposición y el enfoque. Configure los parámetros de la cuadrícula para las mediciones de indentación y registre una matriz de curvas de fuerza-distancia.
Para el procesamiento de datos en el software PyJibe, abra el archivo que contiene la curva de desplazamiento de fuerza. Seleccione la pestaña de preproceso y, en la estimación del punto de contacto, seleccione el ajuste a trozos con línea y polinomio. A continuación, seleccione la pestaña de ajuste y, en modelo, seleccione dentador esférico, en método, seleccione nelder.
Para el análisis viscoelástico en el software PyJibe, abra el archivo que contiene la curva de fuerza distancia. Seleccione la pestaña de preproceso y, en la estimación del punto de contacto, seleccione el ajuste a trozos con línea y polinomio. A continuación, seleccione la pestaña de ajuste y, en modelo, seleccione el modelo de Hertz corregido por viscoelasticidad mediante el modelo KVM.
En método, seleccione leastsq. Establezca el radio preciso del penetrador en 10 micrómetros y la velocidad de aproximación en 7,5 micrómetros por segundo. Presione Aplicar modelo y Ajustar todo para obtener los módulos de Young aparentes y no relajados, la viscosidad aparente y el tiempo de relajación del elemento Maxwell.
Las mediciones aparentes del módulo de Young del radio y el cúbito en extremidades intactas no mostraron diferencias significativas. Durante la fase de histólisis, los módulos aparentes de Young del radio y el cúbito disminuyeron drásticamente a 0,03 y 0,13 kilopascales respectivamente. Los módulos de Young aparentes en el centro del cartílago intacto eran más altos que en la periferia.
En la etapa de histólisis, las mediciones aparentes del módulo de Young no mostraron diferencias significativas entre el centro y la periferia del cartílago. Durante la condensación del cartílago, los módulos aparentes de Young aumentaron significativamente a 0,77 kilopascales, lo que representa valores de rigidez intermedios. Los módulos no relajados mostraron diferencias sustanciales en el tejido intacto durante la histólisis y en el cartílago condensado.
Los módulos aparentes de Young fueron muy similares a los módulos no relajados, lo que indica una respuesta predominantemente elástica. La viscosidad aparente fue significativamente menor durante la histólisis en comparación con el tejido intacto y el cartílago en condensación.
