Para comenzar, coloque los reactivos necesarios para la preparación de la electroforesis en gel en una plataforma de trabajo. Agregue Tris / Borato / EDTA, o TBE, a la agarosa y caliente la solución en un microondas. A continuación, vierte el 0,4-0,5% de agarosa en una bandeja de fundición para preparar un gel de agarosa de primera dimensión y déjalo solidificar durante una hora.
Después de la solidificación, cargue la escalera dentro de los primeros 3 centímetros en relación con el borde más izquierdo del gel. A continuación, cargue las muestras de ADN digeridas con enzimas de restricción, asegurando una distancia de 3 centímetros entre cada par. Haga funcionar el gel en TBE durante 19-24 horas a 0,85 voltios por centímetro para separar los intermedios por tamaño.
Al día siguiente, retire el gel del tampón. Extirpa los primeros 3 centímetros del gel que contiene la escalera. Teñir el segmento de gel en TBE que contenga 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio durante 10-15 minutos.
A continuación, visualice la escalera utilizando un sistema de documentación de gel. En el gel de agarosa, agregue 1,3 centímetros a la ubicación estimada, lo que da un valor de A. Luego reste 7,5 centímetros del valor A, obteniendo el valor B. Alinee la regla contra el gel de primera dimensión y corte horizontalmente a través de los valores A y B. Luego corte verticalmente el espacio de 3 centímetros reservado para cada muestra. En una nueva bandeja de fundición, gire los segmentos en el sentido de las agujas del reloj y colóquelos en la posición de los pocillos de muestra.
Prepare el gel de agarosa de segunda dimensión a una concentración de 1-1,3% en TBE con 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio. Calienta el gel y, al enfriarlo a aproximadamente 55 grados centígrados, viértelo sobre los segmentos de primera dimensión girados. Deje que el gel se solidifique durante una hora.
Después de la solidificación, transfiera el gel a una cámara que contenga TBE a 0,3 microgramos por mililitro de bromuro de etidio y deje que se equilibre durante 30 minutos. Cubra el gel y déjelo funcionar durante 9-10 horas a 4,23 voltios por centímetro a 4 grados centígrados. Retire el gel de segunda dimensión de la cámara y depurine los fragmentos de ADN durante 10 minutos en una solución de ácido clorhídrico de 0,24 molares con un balanceo suave.
Enjuague el gel con agua desionizada y sumérjalo en hidróxido de sodio 0,4 molar durante 10-15 minutos. A continuación, doble dos hojas largas de papel de cromatografía perpendiculares a la hoja de vidrio, extendiéndolas hacia el recipiente. Para ensamblar el Southern blot, llene un recipiente con 1 litro de hidróxido de sodio 0.4 molar.
Alinee una hoja de vidrio larga a lo largo del recipiente. Humedece la parte superior del papel con hidróxido de sodio y retira con cuidado las burbujas de aire debajo de su superficie. Remoje tres hojas de papel de cromatografía con hidróxido de sodio y colóquelas sobre el papel de la carpeta.
Retira las burbujas de aire. Dale la vuelta al gel de segunda dimensión y colócalo sobre los papeles de cromatografía. Humedece una membrana de nailon cargada positivamente con agua desionizada y colócala sobre el gel.
A continuación, coloque tres láminas de cromatografía humedecidas con agua desionizada sobre la membrana. Cubra cualquier hidróxido de sodio expuesto en el recipiente con una envoltura de plástico para evitar la evaporación. Coloque una pila de servilletas o toallas de papel de 0,3 a 0,5 metros de altura sobre la mancha.
Comprima toda la mancha con un peso para facilitar la acción capilar apretada y déjela durante dos días para que el ADN se transfiera a la membrana.
