Para comenzar, retire los viales de seda FN del congelador a menos 80 grados centígrados y colóquelos en hielo seco para su transporte. Lleve los viales a un gabinete de seguridad biológica y colóquelos en un estante de tubos de microcentrífuga. Al descongelar, pipetee 550 microlitros de solución de seda en cada segundo pocillo de una placa de 48 pocillos.
Coloque la tapa en el plato y colóquela dentro de una caja estéril. Transfiera con cuidado la caja del gabinete de seguridad biológica y déjela en condiciones ambientales durante la noche. Al día siguiente, introduzca la caja que contiene la placa con las membranas de seda FN y los insertos estériles en el armario de seguridad biológica.
Levante con cuidado la placa de la caja, abra la tapa de la placa y verifique visualmente la formación de membrana observando la turbidez en los pozos. Con pinzas estériles, tome un inserto y guíelo hacia abajo sobre la membrana hasta que las manijas toquen la parte superior del pocillo. Una vez que se hayan bajado todos los insertos, coloque la tapa en la placa y devuelva la placa a la caja estéril.
Deje que las membranas se adhieran a los insertos durante dos horas. A continuación, retire el plato de la caja y abra la tapa. Con unas pinzas estériles, retire el inserto del pocillo.
Llene el inserto con 100 microlitros de DMEM/F12 para la siembra basal, o 200 microlitros para la siembra apical. Transfiera el inserto a un pocillo vacío de una placa de 24 pocillos y llene el pocillo con un mililitro de DMEM/F12. Después de recolectar el número deseado de queratinocitos humanos, utilizando una pipeta P200, aspire de 20 a 50 microlitros de suspensión celular.
Dirija la punta de la pipeta hacia el centro de la membrana y presione lentamente el émbolo de la pipeta, poniendo la gota en contacto con el medio de cultivo dentro del inserto. Una vez que se transfieren todas las membranas, mueva la placa en un patrón en forma de ocho para distribuir las células de manera uniforme a través de las membranas. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Con unas pinzas, levante los insertos de la placa de 24 pocillos, dejando el medio de cultivo en los pocillos. A continuación, invierta el inserto de modo que el lado basal quede hacia arriba. Coloque el inserto invertido en la placa de Petri.
Aspire 20 microlitros de la suspensión de células de queratinocitos humanos resuspendidos con una pipeta P200. Apunte la punta de la pipeta hacia el centro de la membrana y presione lentamente el émbolo de la pipeta para formar una gota que caiga sobre la membrana. Coloque la tapa en la placa de Petri.
Transfiera la placa de Petri y la placa de 24 pocillos que contiene medio a la incubadora durante 30 minutos. Después de la incubación, lleve la placa de 24 pocillos y la placa de Petri al gabinete de seguridad biológica. Con unas pinzas, tome un inserto e inviértalo de modo que el lado apical de la membrana mire hacia arriba y el lado basal hacia abajo.
Con una pipeta P200, agregue 200 microlitros de medio de cultivo dentro del inserto. Vuelva a colocar el inserto en un pocillo prellenado de la placa de 24 pocillos. Cultive los insertos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Los queratinocitos cultivados en la membrana de seda FN cubrieron uniformemente la superficie y mostraron morfología de adoquín el primer día. Los queratinocitos formaron una capa confluente al tercer día, lo que indica la función epitelial, y formaron una red de uniones estrechas que indican que estaban asumiendo funciones epiteliales fisiológicas. Se observó una alta viabilidad celular a través de las membranas de seda FN después de tres días, sin diferencias significativas en la viabilidad entre el centro y la periferia.
El sistema de membrana FN-silk apoyó la viabilidad de los queratinocitos similar o mejor que los sistemas comerciales de membranas PET.
