Para comenzar, recoja el tejido ovárico del quirófano después de la biopsia en un tubo que contenga cinco mililitros de DPBS 1X suplementado. Con un bisturí estéril, corte un pequeño trozo de tejido ovárico de unos dos milímetros de la superficie del ovario. A continuación, sumerja el tejido en 350 microlitros de solución de Bouin a temperatura ambiente durante dos horas.
Después de la incubación, lavar el tejido con etanol al 70% tres veces. Después de incrustar y seccionar los tejidos, realice la tinción con hematoxilina y eosina y adquiera imágenes digitales para su análisis. Abra los archivos con el software adecuado, como QuPath.
Arrastre el archivo a la ventana principal de QuPath y establezca el tipo de imagen en Brightfield H&E. Defina un milímetro del epitelio de la superficie usando la barra de escala. Haga clic en la herramienta elipse y anote los folículos.
Cuente el número de folículos dentro de esta área de un milímetro desde la etapa de maduración primordial hasta la primaria. Ingrese el ID de la muestra, la edad, el número de folículos para cada portaobjetos, el grosor de la sección y la sección N contada en la hoja denominada Folículo en cubo milimétrico en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z de folículos. Después de identificar el 10% más grande de los folículos en cada sección contada, haga clic en la herramienta de línea y dibuje dos líneas perpendiculares a través de la membrana del ovocito.
Seleccione Medir, luego haga clic en Mostrar medidas de anotación para determinar el diámetro medio de estos ovocitos. Registre las medidas debajo de la columna etiquetada como longitud en micrómetros. Introduzca el diámetro medio de los ovocitos de los folículos del 10% más grandes en micrómetros para cada portaobjetos en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z de folículos.
Coloque la imagen en el centro de la pantalla en QuPath y haga clic en el icono de ImageJ. A continuación, seleccione Enviar instantánea a ImageJ. En ImageJ, demarque un milímetro del borde con la herramienta de pincel y haga clic en Imagen, luego en Tipo y seleccione 8 bits.
A continuación, haz clic en la herramienta de línea y dibuja una línea en la barra de escala. Seleccione Analizar, luego Establecer escala, ingrese la longitud indicada en la barra de escala en el campo Distancia conocida y haga clic en Aceptar. A continuación, haz clic en Imagen, luego ajusta Brillo/Contraste y selecciona Automático. Ahora haga clic en Imagen, luego ajuste el Umbral y seleccione Automático.
Haga clic en la herramienta de varita, seleccione el área y luego presione Ctrl M.Ingrese el valor del área en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo. Una vez que todos los datos estén tabulados en el archivo de Excel de la calculadora de folículo Z-Score, vaya a la hoja llamada Z-Score folículo por milímetro en el mismo archivo de Excel para determinar si hay una reserva ovárica reducida. El epitelio superficial del ovario de un niño era claramente visible, con la reserva ovárica residiendo debajo de él después del procedimiento de tinción.
Se utilizó la densidad de folículos para calcular las puntuaciones Z de reserva ovárica, con una puntuación Z inferior a 1,7 negativo, lo que indica una reserva ovárica reducida.
