Para comenzar, coseche las semillas de plantas mutantes y X134, y déjelas secar naturalmente a temperatura ambiente hasta que el contenido de humedad alcance aproximadamente del 13 al 15%Después de activar la máquina peladora, introduzca 10 g de granos de arroz en el alimentador para eliminar eficazmente la cáscara de la gluma. Transfiera las semillas de arroz peladas al molino de arroz y opere la máquina durante 60 segundos para eliminar la capa de aleurona que produce arroz pulido. A continuación, coloque el arroz pulido en el molinillo de pañuelos.
Ajuste la frecuencia de molienda a 60 Hz y haga funcionar el molinillo durante 15 segundos durante dos ciclos para producir polvo de arroz. Deposite el polvo de arroz molido en una placa de Petri y colóquelo en un horno precalentado a 37 C durante 12 horas. Luego agregue 100 mg de polvo de arroz en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y golpee suavemente el tubo.
Añadir 180 L de agua purificada al tubo y hervir la muestra en un baño de agua durante 20 minutos. Después de que la muestra se enfríe, introduzca 4 mL de alfa amilasa pancreática que contenga AMG en el tubo. A continuación, mezcle el contenido en un oscilador de vórtice e incube el tubo a 37 C durante 16 horas con agitación continua.
Ahora, agregue 4 mL de etanol y mezcle la muestra usando un vórtice. A continuación, centrifugar el tubo a 1.500 g durante 10 minutos. Después de decantar el sobrenadante, añadir 2 mL de etanol al 50%, seguido de 6 mL de IMS al 50% al tubo y mezclar.
Después de centrifugar el tubo, vierta con cuidado el sobrenadante e invierta el tubo para drenar el exceso de líquido. Colocando el tubo en un baño de hielo, agréguele 2 mL de hidróxido de potasio 2 molares y agite la muestra durante 20 minutos para volver a suspender el lote y disolver el almidón resistente. Añadir 8 mL de tampón de acetato de sodio 1,2 molar ajustado a pH 3,8 al tubo y mezclar con un agitador magnético.
A continuación, introduzca inmediatamente 0,1 ml de AMG en la mezcla y mezcle bien. Incubar la muestra durante 30 minutos a 50 C en un baño de agua con mezcla intermitente utilizando un vórtice. Después de la incubación, centrifugar el tubo a 1.500 g durante 10 minutos.
Ahora transfiera 0,1 mL del sobrenadante a un tubo de vidrio nuevo. Añadir 3 mL de reactivo de glucosa oxidasa peroxidasa e incubar la muestra a 50 C durante 20 minutos. Pipetee con cuidado 200 L de cada solución de muestra en blanco y solución estándar en una placa de 96 pocillos.
Mida la absorbancia de cada muestra a 510 nm frente a la solución en blanco y calcule el contenido de almidón resistente utilizando la fórmula. Por último, obsequiar a los participantes con 50 g de arroz preparado con 200 mL de agua. Después de la comida, recoja muestras de sangre venosa en varios puntos del momento para realizar el análisis de glucosa en sangre.
El contenido de almidón resistente fue significativamente mayor en el mutante SBEIIb con un 5,2% en comparación con el tipo salvaje. El consumo del arroz preparado condujo a una respuesta de glucosa más lenta y reducida a los 15 y 30 minutos, con reducciones del 9,7% y 3,7% respectivamente.
