Este trabajo es apoyado por una beca de EE.UU. National Science Foundation de Christoph Benning.

1. La extracción de lípidos <ol><li> Comenzar la extracción de lípidos de la cosecha de 30 mg de 4 semanas de edad, hojas de Arabidopsis a partir de plantas cultivadas en agar solidificado medio o en el suelo y transferirlas a tubos de 1,5 ml de la reacción de polipropileno. Las hojas frescas se puede flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. </li><li> Añadir 300 l de extracción de solventes compuesto por metanol, cloroformo y ácido fórmico (20:10:01, v / v / v) para cada muestra. Agitar vigorosamente (con un agitador de pintura o similar) durante 5 minutos. </li><li> Añadir 150 ml de ácido fosfórico 0,2 M (H 3 PO 4), 1 M de cloruro de potasio (KCL) y agitar brevemente. </li><li> Se centrifuga a 13.000 xg a temperatura ambiente durante 1 minuto. Lípidos disueltos en la fase inferior de cloroformo se colocan sobre placas TLC. </li></ol> 2. Cromatografía en capa fina (TLC) 15 <ol><li> Para preparar las placas de TLC, se sumergen una placa de gel de sílice recubiertas 20cmx20cm TLC con la carga de la tira durante 30 segundos en 0,15 M de sulfato de amonio ((NH 4) 2 SO 4) solución, después de sumergir durante 30 segundos, secar la placa por lo menos 2 días un recipiente tapado. Durante la activación de la sublimación de amonio deja tras de ácido sulfúrico, que protona fosfatidilglicerol necesarios para su separación de glicerolípidos otros. </li><li> En el día de experimento, activar TLC placas de hornear en un horno a 120 ° C durante 2,5 horas. </li><li> Después del enfriamiento de las placas activa a temperatura ambiente, utilice un lápiz para dibujar una línea recta (1,5 cm del borde de la placa) a través de la placa en el origen del cromatograma. </li><li> En una campana extractora, lentamente entregar 3 x 20 l de extracto de lípidos en la fase inferior de cloroformo con una pipeta 20 ml con 200 l puntas amarillas de plástico bajo una corriente lenta de N 2. Para ello, un tubo de Tygon se conecta al regulador de la N 2 tanque. Mantenga el lugar de menos de 1 cm de diámetro. Cada placa tiene capacidad para 10 muestras (al posterior análisis de GLC está previsto). </li><li> Como los lípidos manchas completamente seca en la campana de humos, preparar el disolvente de desarrollo compuesto de acetona, tolueno, agua (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si la humedad ambiental relativa del aire es alta, la separación podría ser afectada. En este caso el agua debe ser reducida para dar (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) para conseguir la separación deseada. </li><li> Verter 80 ml de disolvente en el desarrollo de un TLC sellar el desarrollo de la cámara (L: H: W = 27,0: 26,5: 7.0, cm / cm / cm) y se coloca la placa en el tanque con el fin de la muestra hacia abajo. Sellar el tanque con la abrazadera. El disolvente ascenderá la placa y los lípidos se separarse. El tiempo de desarrollo es de aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Cuando el frente del disolvente se sitúe a 1 cm de la parte superior de la placa, retire con cuidado la placa de la cubeta y se seque por completo en la campana de humos durante 10 minutos aproximadamente. </li><li> Lípidos separados por TLC puede ser reversible manchado brevemente con yodo para el análisis cuantitativo o irreversiblemente teñidas con ácido sulfúrico o α-naftol. <ol><li> Sulfúrico carbonización ácido: Pulverizar la placa con el 50% de ácido sulfúrico en agua en una botella rociadora de vidrio en la campana extractora de humos y hornee a 120 ° C durante 15 minutos (Figura 2). </li><li> α-naftol la tinción de glicolípidos: Pulverizar la placa con el 2,4% (w / v) α-naftol en el 10% (v / v) de ácido sulfúrico, 80% (v / v) de etanol y hornee a 120 ° C durante 3-5 minutos hasta que las bandas glicolípido se tiñen de color rosa o púrpura (Figura 2B). El tratamiento excesivo dará lugar a la carbonización de todos los lípidos debido a la presencia de ácido sulfúrico en el reactivo. </li><li> Tinción de yodo: en una campana de extracción, se coloca la placa en un tanque cerrado TLC con cristales de yodo (en una bandeja en la parte inferior que conduce a la saturación de la atmósfera con vapor de yodo hasta que los lípidos son visibles). No exponga la placa de yodo mucho tiempo como el yodo covalente puede modificar los ácidos grasos poliinsaturados (Figura 2C). Por otra parte, para evitar la oxidación de los lípidos, sólo los carriles estándar intercalados con los carriles de la muestra debe ser manchada con una lana de vidrio conectado pipeta Pasteur con cristales de yodo a través del cual N 2 es soplado sobre carriles individuales estándar. </li></ol></li></ol> 3. Acil éster metílico (FAME) Reacción 16 <ol><li> Eliminar la sílice rodean identificado puntos de lípidos de la placa de TLC con una cuchilla de afeitar. Raspe la sílice que contienen lípidos y transferir el polvo de sílice usando un embudo en un tubo de vidrio con tapón de rosca de teflón (PTFE) a ambos lados. </li><li> Añadir 1 ml 1 N de ácido clorhídrico (HCl) en metanol anhidro a cada muestra por pipeta. </li><li> Añadir 100 ml de 50 mg mL -1 pentadecanoico ácido (15:00) con una pipeta 200 l de cada muestra como patrón interno con una pipeta 200 l con 200 l punta de plástico amarillo. Mantenga un tubo con sólo ácido pentadecenoic metanólica de HCl como un control. Cerrar los tubos de vidrio herméticamente con tapas recubierto de teflón. </li><li> Incubar gltubos de culo en un baño de agua de 80 ° C durante 25 minutos. Los tubos deben ser sellados para que el disolvente no se evapora. </li><li> Después de los tubos se hayan enfriado, añada 1 ml de cloruro de sodio al 0,9% seguido de un ml de hexano y agitar vigorosamente. Centrifugar las muestras a 1000xg durante 3 minutos. </li><li> En la campana extractora de humos, retire la capa de hexano / superior de la muestra con pipeta Pasteur y colocarla en un tubo de vidrio nuevo 13x100 mm. </li><li> Evaporar hexano bajo una corriente lenta de N 2 sin secar por completo. </li><li> Disolver el resultado acil methylesters s en 60 l de hexano. Transferencia de las muestras en viales muestreador automático y tapa. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C para el corto plazo y -20 º C durante unos días. </li></ol> 4. Cromatografía de gas líquido (GLC) 10 <ol><li> Antes de comenzar GLC, asegúrese de que el hidrógeno helio, y los cilindros de aire se llenan. </li><li> Hexano suficiente hay que añadir a la reserva de disolvente y el contenedor de residuos debe estar vacío. Para la separación de grasas methylesters acilo, adjuntar una DB-23 columna de la máquina. </li><li> Viales lugar en el inyector automático. Inicie el software ChemStation en la CGL en el sistema informático. </li><li> Ajuste la temperatura de entrada a 250 ° C con una tasa de flujo de helio a 48.6 mL min-1 y la presión a 21,93 psi. La relación de separación es de 30,0: 1. </li><li> La temperatura del horno se establece inicialmente a 140 ° C durante 2 minutos y elevó a 160 ° C a una velocidad de 25 ° C min -1. A continuación, ajuste la temperatura aumentará de 160 ° C a 250 ° C a una velocidad de 8 ° C min -1 y mantener a 250 º C durante 4 minutos seguido de una disminución a 140 ° C a una velocidad de 38 ° C min - 1. Una carrera dura aproximadamente 21 minutos. </li><li> La temperatura del detector de ionización de llama es de 270 ° C con un caudal de hidrógeno de 30.0 mL min-1, la tasa de flujo de aire a 400 mL min-1 y la tasa de flujo de helio a 30.0 mL min-1. </li><li> Introduce el número de viales y nombre de la muestra en la tabla de secuencia de ejecución. Ajuste el inyector de 10 l para inyectar 2 l de la muestra por vial. </li><li> Cuando el instrumento está listo, inicie la secuencia de ejecución. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Ejemplos de tinción irreversible del TLC separados por los lípidos de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad se muestra en la Figura 2. Los lípidos de ácido sulfúrico manchada (Figura 2A) están carbonizados y aparecen como manchas de color marrón. α-naftol se prefiere a la mancha glicolípidos como MGDG, DGDG, SQDG glicolípidos etc teñidas con α-naftol llevar un color rosa-púrpura, mientras que otros lípidos polares mancha amarilla (Figura 2B). La tinción de yodo es reversible y lípidos da un color amarillento que va a desaparecer en un corto tiempo se evapora el yodo (Figura 2C). Lípidos brevemente manchados de yodo puede ser objeto de análisis por GLC a pesar de lípidos sin manchas son preferibles a reducir la descomposición de los lípidos. Si se hace correctamente, las señales distintivas que representan a diferentes grasos éster metílico de acilo se podrá realizar GLC (Figura 3). Éster metílico de acilo graso con cadena de carbono más cortas y menos enlaces dobles tienen menor tiempo de retención con el DB-23 de la columna. Acil perfiles de éster metílico es una herramienta sensible para identificar mutantes con la composición de lípidos alterados. En la Figura 4, el MGDG18: 3 proporción de ácidos grasos molar se encuentra disminuida en el mutante tgd4-1 en comparación con el tipo salvaje de 18 años. Dividiendo los moles de éster metílico de acil grasos de los lípidos de clase uno con los moles de todas las clases de lípidos, la relación molar de cada uno de los lípidos se calculan. Por ejemplo, para calcular la proporción molar de MGDG: (MGDG)% mol = Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (total)] x 100% Las proporciones resultantes molar de cada clase de lípidos, tanto la de tipo salvaje y el mutante se puede comparar. Por ejemplo, el mutante tgd4-1 ha aumentado las cantidades relativas de MGDG y PG, pero disminuyeron las cantidades de DGDG y PE (Figura 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama de flujo del análisis de los lípidos polares con plántulas de Arabidopsis. Lípidos totales se extraen de plantas Arabidopsis de 4 semanas de edad, y separados por TLC. Los lípidos separados puede ser raspado de la placa de TLC para la transesterificación seguida de análisis por GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Separación de los lípidos en las placas de TLC. Extractos de lípidos de 35 mg (peso fresco) plántulas de tipo silvestre están separados por TLC y teñidas por el ácido sulfúrico (A), α-naftol (B) o el vapor de yodo (C). Tres repeticiones se muestran en cada método de tinción. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, la fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidilinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Análisis por GLC de Methylesters ácidos grasos (FAME) derivado de MGDG del tipo salvaje. FAME se separan en una columna de 30 m capilar y detectados por ionización de llama. Pentadecanoico ácido (15:00) se utiliza como estándar interno. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Perfil de ácidos grasos de MGDG en el tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Los ácidos grasos se presentan como el número de carbonos seguido por el número de dobles enlaces. Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Composición de los lípidos polares del tipo salvaje Col2 (columnas blancas) y el tgd4-1 mutante (columnas de negro). Tres repeticiones se hacen un promedio y las desviaciones estándar se muestran con barras de error.

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TLC, junto con GLC proporciona una herramienta robusta y rápida para el análisis cuantitativo de los lípidos polares en las plantas. Pequeños cambios en la composición de los lípidos se pueden identificar, por lo tanto, este método ha sido utilizado para la detección a gran escala de los mutantes de alteración en los lípidos polares vías metabólicas 1,20. Este método también se usa ampliamente para las actividades de control de las enzimas que utilizan los lípidos polares como sustrato. 2,6,7 Además de las hojas, la composición de los lípidos de los tejidos vegetales tales como las raíces y las semillas o fracciones subcelulares como los cloroplastos y las mitocondrias también se puede determinar de la misma manera. El sistema de solventes (acetona, tolueno, agua) que se utiliza aquí está optimizado para la separación de glicolípidos y fosfolípidos en las plantas. Sin embargo, en tgd1, 2,3,4 mutantes y los cloroplastos aislados, TGDG corre junto con el PE, mientras que tetragalactosyldiacylglycerol funciona con PC. En este caso, un sistema disolvente de cloroformo, metanol, ácido acético y agua (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) se utiliza 13. A veces, una TLC bidimensional utilizando dos sistemas de solventes diferentes se realiza para separar aún más glicolípidos y fosfolípidos 19. Además, los tejidos de las plantas pueden estar directamente sometidos a la reacción FAME seguido por GLC para determinar el perfil de ácidos grasos totales, sin separación inicial de TLC 5. Junto a la demostrada TLC-GLC sistema, otro método utilizado para la creación de perfiles de lípidos se basa en la ionización directa de masas electrospray tandem espectrometría 17. En este método la separación cromatográfica inicial de lípidos en el extracto se omite. Sin embargo, este método requiere un equipo costoso y personal experimentado, que hace que sea menos útil para los análisis de rutina en el laboratorio o para la detección de mutantes.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>&alpha;-naphthol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanolic HCL 3N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>33050-U</td>
<td>Dilute to 1N by methanol</td>
</tr>
<tr>
<td>Si250-PA TLC plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>7003-04</td>
<td>With pre-absorbent </td>
</tr>
<tr>
<td>TLC chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z266000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw cap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53283-800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scew caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>13-425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTFE disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>200 608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GLC system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hewlett Packard</td>
<td>HP6890</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DB-23 column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J&amp;W Scientific</td>
<td>122-2332</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GLC vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>500 132</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps of GLC vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>201 828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chemstation software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2070AA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

arabidopsis thaliana polar glycerolipid profiling by thin layer chromatography (tlc) coupled with gas-liquid chromatography (glc)

Las células de las membranas biológicas separado del medio ambiente. De una sola célula de plantas y animales multicelulares, glicerolípidos, tales como la fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, membranas forman dos capas que actúan como los límites y las interfaces para el intercambio químico entre las células y su entorno. A diferencia de los animales, las células vegetales tienen un orgánulo especial para la fotosíntesis, los cloroplastos. El sistema de membranas de los cloroplastos intrincada contiene glicerolípidos única, es decir, glicolípidos que carecen de fósforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Las funciones de estos lípidos están más allá de simplemente estructural. Estos glicolípidos y glicerolípidos otros fueron encontrados en las estructuras cristalinas del fotosistema I y II que indica la participación de glicerolípidos en la fotosíntesis 8,11. Durante la hambruna de fosfato, DGDG se transfirieron a membranas de extraplastidic para compensar la pérdida de los fosfolípidos de 9,12. Mucho de nuestro conocimiento de la biosíntesis y la función de estos lípidos se ha derivado de una combinación de estudios genéticos y bioquímicos con 14 Arabidopsis thaliana. Durante estos estudios, un procedimiento sencillo para el análisis de los lípidos polares ha sido esencial para la detección y el análisis de mutantes de lípidos y se describen en detalle. Un extracto lipídico de la hoja es primero separado por cromatografía en capa fina (TLC) y glicerolípidos se tiñen de forma reversible con vapor de yodo. Los lípidos son individuales raspado de la placa de TLC y se convierte en grasa methylesters acilo (FAME), que son analizados por cromatografía de gases acoplada con detección de ionización de llama (FID-GLC) (Figura 1). Este método ha demostrado ser una herramienta fiable para la detección de mutantes. Por ejemplo, el tgd1, 2,3,4 retículo endoplasmático a plastidio mutantes tráfico de lípidos fueron descubiertos sobre la base de la acumulación de una galactoglycerolipid anormal: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) y una disminución en la cantidad relativa de 18:3 (carbones: doble bonos) grupos acilo grasos en los lípidos de membrana 3,13,18,20. Este método también es aplicable para la determinación de actividades enzimáticas de las proteínas con los lípidos como sustrato 6.

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Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

36.4K vistas.  Michigan State University. Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

Video: Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral dip transformación de la Arabidopsis thaliana Para el Examen de PTSO2:: β-glucuronidasa Reporter Expresión Génica

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Análisis del comportamiento de crecimiento de Arabidopsis thaliana en diferentes calidades de luz

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Uso de Microtiter Dish Radiolabeling para mediciones múltiples in Vivo de Escherichia coli (p)ppGpp seguido de cromatografía de capa fina

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Investigación espacio-temporal de la dinámica de ERL1 mediante imágenes confocales

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Autor destacado: Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...