This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Nota: Este protocolo fue adaptado de Buenaventura et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Los pasos 1-5 se resumen en la Figura 1. Eliminación de lípidos 1. Tejido Nota: Siempre enjuague toda la cristalería y las tapas con cloroformo, dejando seco bajo campana de extracción, antes de usar. PRECAUCIÓN: Realice homogeneización del tejido y todas las etapas de transferencia de disolvente bajo campana de humos; siempre use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad salpicaduras para evitar el contacto directo con productos químicos y proteger las muestras de la contaminación. <ol><li> Baño de agua Precaliente y el bloque de calor a 85 ° C. </li><li> Pesar aproximadamente 0,5 g de cada muestra de hoja en mm x 125 tubos de ensayo de vidrio pesados ​​previamente 20 mm con politetrafluoroetileno (PTFE) tapones de rosca -faced. Incluya cuatro réplicas por muestra. </li><li> Coloque 2-propanol en un matraz Erlenmeyer (aproximadamente 125 ml; 25 ml por g de sample). Añadir 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (también conocido como hidroxitolueno butilado, BHT) a una concentración final de 0,01% (w / v). Nota: Añadir BHT desde un 5% (w / v) solución madre en metanol (BHT ayuda a minimizar la oxidación de los ácidos grasos insaturados). </li><li> Precalentar solución de 2-propanol a 85 ° C en baño de agua. </li><li> Añadir 12 ml de disolvente caliente 2-propanol a cada tubo de muestra y el calor durante 15 min a 85 ° C en el bloque de calor. Este paso inactiva lipasas que pueden ser liberados de células rotas. </li><li> Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente y moler el tejido a fondo con un homogeneizador hasta que se obtiene una suspensión homogénea. </li><li> Colocar las muestras en un agitador orbital y agitar durante 1-2 horas a 100 rpm y la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen igual de 2-propanol y agitar durante 12 horas a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 12 ml de CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) al residuo (25 ml por g de muestra) y agitar durante la noche a 100 rpm y la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 12 ml de CHCl3: CH3OH (1: 2, v / v) al residuo y agitar durante la noche a 100 rpm y la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 800 xg y eliminar el disolvente. </li><li> Deje que las muestras se secan bajo campana de humos durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Seque el residuo y luego se coloca en un desecador de vacío sobre CaCl 2 anhidro o CaSO 4 hasta peso constante se alcanza (3-5 días). </li></ol> 2. La despolimerización: metanolisis con metóxido de sodio (Figura 2) PRECAUCIÓN: Siga los pasos 2.3 a 2.4, 2.7 a 2.8, 2.10 a 2.11, 02.13 a 02.15 y de 02.17 a 02.18 bajo campana de humos; siempre use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad salpicaduras. <ol><li> Precaliente el bloque de calor a 60 ° C. </li><li> Pesar tubos de ensayo que contienen el residuo seco (importante para los cálculos posteriores). </li><li> Añadir estándares internos a cada tubo: 25 ωL heptadecanoato de metilo (1 mg / ml) y 25 l ω-pentadecalactona (1 mg / ml). </li><li> Añadir 0,9 ml de acetato de metilo, 1,5 ml de metóxido de sodio, y 3,6 ml de metanol a cada tubo y la tapa ellos. Alternativamente, preparar una mezcla de reacción con estos tres reactivos y añadir partes alícuotas de 6 ml a cada muestra. </li><li> Muestras de calor durante 2 horas a 60 ° C y agitar periódicamente en intervalos de 15 min. </li><li> Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 10 ml de dicloruro de metileno (CH 2 Cl 2) y 1,5 ml de ácido acético glacial para extraer los ésteres metílicos de ácidos grasos. </li><li> Añadir solución salina (NaCl 0,5 M) para llenar cada tubo y la tapa. </li><li> Muestras Vortex durante 1 min y se centrifuga durante 10 minutos a 800 x g. </li><li> Pasar la fase orgánica (inferior) para limpiar los tubos de tamaño mediano (16 x 125 tubos de ensayo de vidrio mm con politetrafluoroetileno (PTFE) tapón de rosca -faced). </li><li> Añadir solución salina (NaCl 0,5 M) para llenar cada tubo y la tapa. </li><li> Muestras Vortex durante 1 min y se centrifuga durante 10 minutos a 800 x g. </li><li> Retire fase acuosa (superior) y repita los pasos desde 2,11 hasta 2,12. </li><li> Quite toda la fase acuosa (superior). </li><li> Añadir sulfato sódico anhidro (Na 2 SO 4) para el disolvente, la tapa de los tubos, y de vórtice durante 1 min; muestras pueden ahora ser dejados hasta el día siguiente. En este punto las muestras se pueden dejar durante la noche bajo la campana de humos. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 800 xg para compactar el Na 2 SO 4 de sal en la parte inferior. </li><li> Pasar la fase orgánica a un tubo desechable vaso pequeño (13 x 100 mm tubos de ensayo de vidrio con politetrafluoroetileno (PTFE) con tapón de rosca -faced). </li><li> Se evapora el disolvente a sequedad bajo nitrógeno y pasar a la etapa de derivatización. Si no se procesa inmediatamente, almacenar evaporó muestras a -20 ° C (muestras pueden ser unalso almacenado antes de la etapa de evaporación). </li></ol> 3. Preparación de derivados para cromatografía de gases PRECAUCIÓN: Realice los pasos 3.1.2 y 3.1.5 - 3.1.8 bajo una campana de humos; siempre use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad salpicaduras. <ol><li> Derivados trimetilsililo <ol><li> Precaliente el bloque de calor a 100 ° C. </li><li> Añadir 100 ml de piridina y 100 l de BSTFA (N, O-trimetilsilil-Bis trifluoroacetamida) a cada tubo y la tapa ellos. </li><li> Muestras de calor a 100 ° C durante 10 minutos. </li><li> Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Evaporar las muestras en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Evitar la aplicación de calor a las muestras, los monómeros son muy volátil en este momento. </li><li> Añadir 500 l de 1: 1 (v / v) de heptano: tolueno. </li><li> Muestras Vortex durante 1 min y centrifugar durante 2 minutos a 800 x g. </li><li> Añadir muestras a viales de GC y proceder al análisis mediante GC / MS. </li></ol></li><li> Acetiloderivados Nota: Para la acetilación, modificar pasos 3.1.1-3.1.3 por encima de la siguiente manera (no mostrado en video); 3.1.4-3.1.8 pasos son los mismos: <ol><li> Precaliente el bloque de calor a 60 ° C. </li><li> Añadir 100 l de piridina y 100 l de anhídrido acético (Ac 2 O) a los tubos. </li><li> Muestras de calor 1 hora a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Análisis <ol><li> Utilice una columna HP-5 capilar (30 mx 0,25 mm x 0,25 m de espesor de película) o equivalente (es decir., 5% difenil, 95% dimetilpolisiloxano). Programa de la GC con flujo de gas portador de helio fijado en 1,5 ml / min y la temperatura del horno programada de 150 a 300 ° C a 3 ° C / min. </li><li> Utilice la inyección split (relación 01:10 split) y establecer espectrómetro de masas al modo escanear a través de 40-600 amu (ionización por impacto de electrones). </li><li> Crear una tabla de secuencia que incluye solvente (en blanco), WT y repeticiones mutantes, cada uno usando el método de análisis de la cutina se indica. </li><li> Disolvente de cargay viales de muestra en el carrusel, añadir hexano a viales de jeringa-lavado en el inyector automático si es necesario, y empezar la secuencia. Después de que se completó la secuencia, el total de trazas cromatograma de iones están disponibles para todas las muestras. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Identificar monómeros de poliéster lípido comparando el espectro de masas de cada pico de publicada espectros de masas o buscando una biblioteca comercial si está disponible. </li><li> Para cada pico identificado en el cromatograma corriente iónica total, el uso de sus respectivos tiempos de retención para encontrar las áreas en la tabla de resultados de integración del software de GC / MS (Figura Suplementario 1). </li><li> Para cada monómero (columnas AB), agregue los valores de área se encuentran en la mesa de la integración (Figura Suplementario 1, columna D) a la columna correspondiente para cada replicar muestra en la tabla de Excel de monómeros (Archivo Suplementario 2, columnas CF), que es una hoja de cálculo para cuantificar Arabidopsisderivados cutina TMSi. Utilice Suplementario Archivo 3 si los derivados acetilados se preparan en su lugar. </li><li> Añadir las áreas de cada patrón interno (IS) a las columnas de SI (HK). Para aquellos monómeros que no están derivatizados, ésteres metílicos saber de ácidos grasos (FAME), y ésteres de dimetilo ácido dicarboxílicos (DCA EMD), utilice 17: 0 FAME (IS1) como está para cuantificación (células-púrpura sombreada en la tabla de monómero; Suplementario Archivos 2/3). Para monómeros hidroxilados, incluyendo alcoholes primarios, ácido ferúlico y ácidos ω-hidroxi, utilizar 15: 0 FAME 15-hidroxi (IS2) de IS de elección para la cuantificación compuesto (células verdes shadded en la tabla de monómero; Archivos Suplementario 2/3) . </li><li> Añadir peso de la hoja seca para cada replicar a las columnas AX-BA (Archivo Suplementario 2) o AQ-AT (Suplementario Archivo 3); alternativamente, escanear hojas para calcular áreas de superficie y añadir valores de área a la mesa de monómero de expresar cargas de monómero por unidad deárea de superficie. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

A diferencia de otros biopolímeros tales como ADN y proteínas, lípidos poliésteres planta no están hechos de una plantilla. En cambio, sus composiciones dependen de la especificidad de las enzimas presentes en los tejidos que hacen que estos polímeros extracelulares. Como analiza tal, química del componente componentes son fundamentales para entender la composición de poliéster de lípidos. Los métodos químicos para escindir enlaces éster incluyen saponificación, hidrogenolisis, transmetilación catalizada por ácido, y catalizada por base de transmetilación 2. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas. La saponificación produce hidroxi ácidos grasos libres que pueden sufrir reacciones secundarias. La hidrogenólisis con hidruro de litio y aluminio (LiAlH 4) 16 se ha utilizado para el análisis de la cutina 7. Hidrogenólisis reduce carbonos funcionalizados a los alcoholes y las estructuras originales deben ser inferida por deuteriolysis con deuteruro de litio y aluminio (LiAlD 4). losdesventaja de este enfoque es el requisito de alta resolución GC / MS para comparar el grado de deuteriation de los polioles grasos obtenidos de hacer las asignaciones de sus estructuras. Transesterificación catalizada por ácido con trifluoruro de boro en metanol (BF 3) se ha utilizado con frecuencia en cutina y suberina depolymerizations 8,17,18, pero el reactivo tiene una vida útil limitada y puede introducir artefactos debido a reacciones secundarias 15. Ácido sulfúrico metanólico también produce ésteres metílicos de los monómeros, pero con una mayor proporción de ácidos grasos 2-hidroxi, que presumiblemente no son verdaderos componentes de poliéster de lípidos, en comparación con otros métodos 10. El método de transesterificación catalizada por NaOMe descrito en este protocolo produce ésteres metílicos de ácidos grasos que se derivan mediante sililación de grupos hidroxilo, proporcionando espectros de masas característica para la identificación, o por acetilación para proporcionar derivados más estables de grupos hidroxilo for cuantificación. Un inconveniente de esta técnica es que la hidrólisis compite con transesterificación cuando el agua está presente en la reacción. El agua reacciona con NaOMe (el catalizador) y produce NaOH, que a su vez hidroliza ésteres metílicos de ácidos grasos para producir ácidos libres (Figura 2D). Esta es una reacción secundaria indeseable porque dos picos estarán presentes para cada ácido graso: un éster de metilo y un derivado de éster TMSi, lo que complica el análisis. El uso de reactivos anhidros y la adición de acetato de metilo como un co-disolvente para competir con la saponificación son por lo tanto cruciales pasos para evitar la hidrólisis (Figura 2D). Cutina y suberina contienen entre 1 y 26% de glicerol 4. Sin embargo, este monómero no será detectada por las condiciones experimentales descritas en este protocolo. El glicerol es altamente hidrofílico y, a diferencia de los monómeros de éster metílico de ácidos grasos, será eliminado durante los pasos de lavado de disolventes acuosos. Esta limitación también unaS e aplica a otros métodos de despolimerización cutina, pero glicerol se pueden determinar en la capa acuosa obtenida después de la transesterificación utilizando un método enzimático. Alternativamente, se puede cuantificar utilizando condiciones más suaves (por ejemplo., 0,05 M NaOMe) sin más la extracción de agua para detectar todos los monómeros, incluyendo glicerol 19,20 .Aunque útiles para el propósito de la cuantificación de glicerol, condiciones suaves suelen dar despolimerización incompleta de la cutina y suberina. Si un GC acoplado a un detector de ionización de llama (FID) está disponible, todas las repeticiones pueden ser analizados en este instrumento con fines cuantitativos, después de los picos de una muestra representativa han sido identificados por GC / MS. Alternativamente, los monómeros en los GC / FID huellas se pueden identificar si se conocen sus índices de retención. El detector de ionización de llama tiene especialmente una alta sensibilidad y una amplia gama de proporcionalidad, que es crítico para la cuantificación de mayores y menores componentes de la muestraen carreras individuales. Además, es robusto y fácil de mantener y operar 15. El protocolo descrito permite la fiable y reproducible aislamiento, la identificación y la cuantificación de monómeros de poliéster de lípidos de la planta, lo que permite la caracterización química de los mutantes que difieren en la composición de uno o más monómeros de poliéster de lípidos. El procedimiento es escalable, puede ser fácilmente adaptado para procesar tanto pequeñas como cantidades a granel de diversos materiales de plantas, incluyendo semillas, raíces, hojas, tallos y flores. Datos espectrales de masa de monómeros de poliéster de lípidos de muchas especies se han publicado, por ejemplo., 21-26 y constituyen valiosos recursos para identificar monómeros desconocidos al adaptar este protocolo a otros tejidos y / o especies. Este método es aplicable a las investigaciones de la biosíntesis, regulación y distribución de poliésteres de lípidos en las plantas superiores.

Las plantas vasculares se basan en capas extracelulares que funcionan como barreras impermeables entre tejidos de las plantas y el medio ambiente externo. Estas estructuras de la pared asociada de células lipófilo restringen la infección patógena y regulan el transporte pasivo de los gases, el agua y las sustancias disueltas dentro y fuera de los tejidos vegetales 1. Estas barreras son la cutícula de la planta, una estructura synapomorphic única de plantas 2, y diferentes barreras de difusión que contiene suberina. La cutícula es una capa oleófilo sintetizado por las células epidérmicas y unido a ellos a través de una capa pectináceo en el lado extracelular de la pared celular 3-5. Se recubre los órganos aéreos primarios de las plantas superiores, que funciona como una interfaz vital entre tejidos de las plantas y el medio ambiente. Cutina, la matriz estructural de la cutícula, y suberina son dos poliésteres glicerolípido insolubles asociados con ceras disolvente extraíbles 2,4. Estos l poliméricoipids se componen de derivados de ácidos grasos saturados e insaturados y son tanto estructural como funcionalmente similar. Sin embargo, son distinguibles por diferencias características en los sitios de composición y deposición química. Suberina es un poliéster alifático situado dentro de las paredes celulares de ciertos tejidos internos y externos que forman una pared secundaria. Tejidos suberizadas incluyen periderms de raíces, tubérculos y cortezas de árboles, endodermis de la raíz, capas de revestimiento de semillas, y las heridas cicatrizadas 2. A diferencia de la cutina, el poliéster suberina típicamente contiene alcoholes saturados y ácidos dicarboxílicos mono-insaturados, y una gran proporción de los monómeros de cadena muy larga (C≥20). Cutina es el más abundante de poliéster de lípidos en plantas vasculares 6, y se compone de glicerol y C16-C18 derivados de ácidos grasos interesterificada, tales como ácidos grasos hidroxi e hidroxi-epoxi sustituido 4. Mientras que la composición de polímeros cutinavaría entre especies tracheophyte, los monómeros primarios más predominantes son 10, 16-dihidroxi 16: 0, 18-hidroxi-9,10-epoxi 18: 0 y 9,10,18-trihidroxi 18: 0 ácidos grasos. Curiosamente, Arabidopsis hoja y tallo cutina se componen principalmente de 18: 2 de ácido dicarboxílico 7,8. Cutículas vegetales también presentan una variabilidad considerable en el espesor, que van desde unos pocos nanómetros a varios micrómetros 9. Desde el aislamiento de la cutícula es un paso laborioso y consume mucho tiempo, en particular para las cutículas de hojas muy delgadas, tales como los de Arabidopsis thaliana 8, los métodos que evitan el aislamiento de la cutícula se han desarrollado y validado 7,8. Aquí se describe un protocolo detallado para estudiar la composición de monómeros de cutina en hojas de Arabidopsis thaliana por metóxido sódico (NaOMe) despolimerización catalizada y / espectrometría de masas cromatografía de gases subsiguiente (GC / MS) análisis. Este protocolo ofrece un método robusto para ensayar la composition de poliésteres de lípidos en los tejidos de plantas deslipidada enteros, y ha sido adaptado de protocolos previamente reportados 7,10,11. Muestras de tejidos enteros son primero homogeneizada y exhaustivamente sin lípidos, la eliminación de los lípidos en disolventes extraíble incluyendo cuticular y ceras epicuticulares, lípidos de membrana, y triglicéridos. Residuos de la pared enriquecida de células son luego despolimerizan en sus monómeros de éster de metilo de sodio constituyentes por metanolisis catalizada por metóxido. Grasos ésteres metílicos de ácidos se extraen tras la acidificación, y derivatizarse para obtener sus derivados trimetilsililo o acetilo correspondientes. Residuos derivatizados son muy volátiles, y pueden eluirse de una columna de cromatografía de gases a una temperatura razonable sin alterar su conformación estructural durante el análisis GC / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

El protocolo se describe en este manuscrito está configurado para determinar monómeros de poliéster de lípidos, reduciendo al mínimo las contribuciones de lípidos no cutina 10 Figura 1 presenta una visión general del ensayo, que tiene en total entre 8 (es decir, cutina o suberina.) -. 10 día (desde la recolección inicial del tejido a la obtención de los datos de GC), dependiendo de cómo de largo muestras se dejan secar. El método para despolimerizar poliésteres metanolisis catalizada por una base seleccionada (Figura 2) fue validado previamente para semillas de Arabidopsis, que contienen tanto la cutina y suberina. Los tejidos se homogeneizaron primera y exhaustivamente delipidated para eliminar los lípidos extraíbles con disolventes. El rendimiento residuo después de la extracción, como porcentaje del peso fresco inicial, es por lo general un 6% para A. thaliana Col-0 hojas. Residuos de la pared enriquecida de células se secan en un desecador de vacío y luego despolimerizan en sus monómeros de éster de metilo por constituyentescatalizada por base de transmetilación. Incubación de dos horas fue elegido como el momento crítico requerido para la despolimerización y recuperación de componentes de poliéster de lípidos adecuada. Tiempos de incubación más largos dieron lugar a aumento de los ácidos 2-hidroxi; éstos potencialmente derivan de esfingolípidos membrana 10. Un cromatograma típico si Arabidopsis de tipo salvaje de la hoja cutina se muestra en la Figura 3, para los derivados O -TMSi éter (Figura 3A) y los derivados O acetil (Figura 3B). Cada pico fue identificado por comparación con los espectros de masas de la literatura 7,8 y una base de datos pública 12 protocolo de vídeo .Our muestra cómo preparar derivados TMSi, pero las muestras, alternativamente, puede ser acetilado para derivatizar grupos hidroxilo. Derivados sililados son buenas para fines de identificación porque dan espectros de masas de diagnóstico. Sin embargo, los derivados acetilados son más estables y una buena alternativa a sililaciónmonómeros una vez se han identificado 10. Para ayudar a implementar este protocolo en los laboratorios que sólo han GC acoplado al detector de ionización de llama (FID), GC / FID rastros correspondientes a derivados acetilados de WT monómeros hoja cutina y a una serie de homólogos de las normas de ésteres metílicos de ácidos grasos son también muestra (Figura Suplementario 4). Este método es cualitativo y detecta diferencias cuantitativas entre las muestras, por lo tanto, su valor para el análisis de mutantes. Las cantidades de monómeros individuales se determinan utilizando el método estándar interno de cuantificación, lo que permite comparaciones de la abundancia de monómero entre las muestras. Debe aclararse, sin embargo, que el tamaño máximo (recuento total de iones) puede no reflejar las relaciones molares de los monómeros en el poliéster. Estamos incluyendo tablas editables de monómeros para calcular cantidades de monómero en la hoja de Arabidopsis cutina como ésteres metílicos de ácidos grasos y derivados TMSi (Archivo Suplementario 1), o as<html> derivados tyl (Archivo Suplementario 2) de los alcoholes. Estas tablas pueden necesitar ser adaptados si las muestras se extraen de diferentes órganos o especies de plantas. A modo de ejemplo, hemos analizado Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0) hojas de tipo salvaje y dos alelos nulos mutante previamente caracterizados del gen CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) y att1-2 (m-2 ) 13,14. Monooxigenasas del citocromo P450 de la subfamilia CYP86A codifican putativos omega-oxidasas y participa en suberina y la biosíntesis de monómero cutina. Nuestros resultados (Figura 4) demuestran reducciones significativas en las cargas de los tres principales monómeros de lípidos en las hojas mutantes en comparación con las hojas WT. En consonancia con la función de la enzima predicho, 16: 0, 18: 2, y 18: 1 dicarboxilatos se vieron afectados específicamente en los mutantes Att1. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Visión general de análisis de poliéster de lípidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figura 2. Mecanismo de la reacción de transmetilación catalizada por NaOMe. Los aniones nucleófilos metóxido atacar el carbono cabonyl de poliésteres de lípidos para formar una inestable intermedio tetraédrico (A), que se disocia fácilmente en ésteres metílicos de ácidos grasos y aniones alcóxido (B). Estos alcóxidos son bases conjugadas, y reaccionan con metanol, la regeneración de los aniones metóxido catalíticamente activos, sosteniendo así reacciones de despolimerización adicionales (C). Si el agua está presente en elsistema, reaccionará con metóxido de sodio para formar hidróxido de sodio, una base fuerte que hidroliza irreversiblemente ésteres para producir ácidos grasos libres indeseables. Acetato de metilo se añade como un co-disolvente 15 para eliminar pequeñas cantidades de hidróxido de sodio en el sistema (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figura 3. Representante cromatograma iónico total de tipo salvaje de la hoja de Arabidopsis thaliana monómeros cutina. (A) O trimetilsilil (TMSi) éter y derivados hidroxilo de etilo (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figura 4. cutina composición de monómero de WT Arabidopsis thaliana y dos alelos mutantes nulos del gen CYP86A2. (Mutante-1 = att1-1; mutante-2 = att1-2) Las barras de error representan la desviación estándar de la media (n = 4) . Adaptado de 13, con el permiso de © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Adicional Figura 1. Pico resultados integración tabla de la GC de software / MS. Los picos correspondientes a los monómeros identificados y normas internas se identifican por su retenti<html> a tiempo (columna C) y valores de área se tabulan en la columna D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Suplementario Archivo 2. Tabla de Arabidopsis monómeros cutina (derivados de éter trimetilsilil de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Suplementario Archivo 3. Tabla de Arabidopsis monómeros cutina (derivados O acetil de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxi).com / files / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para descargar este archivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Adicional Figura 4. GC / FID rastros de (AB) de éster metílico de ácido graso (FAME) estándares índice de retención (picos están etiquetados con cada longitud de cadena saturada FAME); y (C) acetilado A. thaliana hoja WT monómeros cutina. Números en pico corresponden a: 16: 0 FAME (1), ferulato (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-diOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dimetil éster del ácido dicarboxílico; FAME: éster metílico de ácidos grasos; IS1: estándar interno 1, 17: 0 FAME; IS2: st internaAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K vistas.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Video: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

El uso de mutantes de Arabidopsis eceriferum para explorar Biosíntesis planta de cutícula

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Investigación

Biología

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

El apareamiento y la separación de la Tétrada Chlamydomonas reinhardtii Para el análisis genético

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...