Me gustaría agradecer al Departamento de Investigación y Estudios de Posgrado para la provisión de fondos para apoyar mi investigación y el Departamento de Medicina Comparada de la vigilancia y asistencia. También me gustaría reconocer el Departamento de Fisiología por su apoyo y orientación, así como los estudiantes y técnicos en mi laboratorio por su ayuda. Por último, me gustaría agradecer a mi post-doctoral mentor, el Dr. Charles E. Murry, de la oportunidad de estudiar durante ese tiempo me enteré de la microcirugía del ratón.

<ol><li> Instrumentos quirúrgicos estériles (Tabla 1) y 3 &quot;aplicadores con punta de algodón se colocan en una underpad estéril. El esterilizador de cuentas (Germinador 500) está encendido. </li><li> Ratones (edad:&gt; 6 semanas; peso:&gt; 18 g) se anestesiaron con una inyección ip de 20μl / g de peso corporal de tribromoethanol (250mg/kg; duración - aproximadamente 40 minutos). </li><li> Cuando los ratones no responden a los pies-una pizca, un lubricante estéril (Lágrimas renovado) se aplica a los ojos para protegerlos de la desecación y el lado izquierdo del pecho está cubierto con crema depilatoria (por ejemplo, Nair) para eliminar el pelo de la piel. </li><li> La depilación se lava con agua tibia y betadine / alcohol hisopado se utiliza para desinfectar el área quirúrgica. </li><li> El ratón es colocado en una almohadilla caliente deltaphase isotérmica que se fija a una mesa de plexiglás. Cada miembro es inmovilizado con cinta adhesiva y un hilo grueso se coloca horizontalmente bajo los dientes de arriba para mantener la mandíbula superior en su lugar. </li><li> La tabla está en posición vertical y una luz de fibra óptica se ilumina directamente sobre la zona del cuello para la iluminación transesofágica. Esto requiere la colocación precisa de tal manera que la apertura de la garganta es visto como un orificio bien iluminada, lo que permite la tráquea para ser visualizados para facilitar la inserción de la tubería de PE. </li><li> El tubo se conecta al ventilador (conectado a un 95% O 2 / 5% CO 2) para administrar ventilación a presión positiva constante (TOPO ventilador, tasa de 125 respiraciones / min; pico de presión inspiratoria 10-12 cmH 2 O; nota * : Los ajustes varían con la cepa y el sexo 1-3). Una vez que la ventilación es confirmado por los movimientos del tórax sincronizado, la conexión se fija a la plataforma con cinta adhesiva para evitar la extubación durante la cirugía. </li><li> Con unas pinzas dentadas para tirar de la piel hacia arriba y lejos del pecho, una hoja de bisturí # 10 estéril conectada a un mango de bisturí n º 3 se utiliza para hacer una incisión de 1,5 cm en la piel paralelo al esternón. </li><li> Curva microtijeras Vanna se utilizan para cortar los músculos pectorales y hacer un pequeño agujero en el músculo intercostal. </li><li> Recta, micro tijeras romas se utilizan para cortar a través de tres costillas. </li><li> El espéculo de 9 mm oftálmica pediátrica se utiliza para retirar la caja torácica. </li><li> Utilizando la pinza curva, tirar el pericardio desde el corazón y el uso de las pinzas dentadas para arrancar suavemente abierta. </li><li> Utilizando el porta-agujas Castroviejo, un punto cónico de 6 mm 3 / 8 hilos de la aguja de la sutura de polietileno de 8-0 por debajo de la descendente anterior izquierda arteria coronaria (a lo largo del eje longitudinal del corazón) perpendicular a ella. <ol><li> Para una ligadura temporal que puede ser eliminado debido a que la reperfusión tiempo, un estéril 0.5-1cm pedazo de PE90 se coloca en el corazón de forma paralela a la arteria coronaria. La sutura, que haya sido enrollado debajo de la arteria coronaria, se ata a la tubería. En el momento en que va a ser liberado, la ligadura se afloja. Esto se puede repetir si lo desea y el tiempo de oclusión / reoclusión puede ser modificado 4. Dependiendo de la duración del protocolo y el tipo de anestesia utilizada, la suplementación puede ser necesaria. </li><li> Para una oclusión permanente, la ligadura atada debajo de la arteria coronaria es simplemente atados. Escaldado y discinesia son evidentes y el extremo largo de la sutura se corta 5.10. </li><li> Para la inyección intramiocárdica (s), una jeringa estéril de Hamilton con una aguja estéril de calibre 30 biselados se introduce en la base del corazón por encima de la zona de la lesión en el lado derecho de la ligadura. La aguja se avanzó hacia la zona de la lesión y se retira un poco para que el bisel se puede ver aproximadamente en la zona fronteriza. Parte de la solución en la jeringa (2-3μl) se inyecta en el corazón y la aguja se mantiene en su lugar. La jeringa se retira otro de 1-3mm y el resto de la solución se inyecta. La jeringa se mantiene en su lugar hasta que la ampolla que se forma por la solución se disipa. La aguja se retira. Si hay algún sangrado, un aplicador de algodón se presiona suavemente sobre el sitio de inserción de la aguja hasta que el sangrado se detiene 5-7. </li></ol></li><li> Una vez que las manipulaciones de miocardio se han completado, los retractores de la costilla se eliminan y la cavidad torácica se cierra con 3.2 puntos de colchonero con sutura 6-0 Surgipro. </li><li> Dos y tres puntos de colchonero se hacen a cerca de los músculos pectorales, 1-3 gotas de bupivacaína al 0,25% 1:10 en solución salina estéril (ratón 0.1ml/25g) se aplica a los músculos y luego 2-3 puntos de colchonero se hacen para cerca de la piel. </li><li> El ratón se retira del ventilador. Una vez que la respiración rítmica, rápida y superficial, se ha verificado, el ratón puede ser extubado. </li><li> 0,5 ml de solución salina estéril caliente se inyecta en el espacio subcutáneo dorsal y el ratón se coloca sobre una plataforma de calentamiento en una jaula hasta que recupera la movilidad (1 hora mínimo). </li><li> Para los experimentos de supervivencia, los ratones se vuelven a colocar en sus jaulas y se devuelve al vivero hasta el momento del sacrificio. Durante los 2 primeros días, se humedece los alimentoscolocado en el piso de la jaula para facilitar la alimentación (por lo que no tiene que llegar hasta lo que puede causar dolor) y la buprenorfina debe ser administrado cada 6 de 12 horas. Atención post-operatoria también incluye el monitoreo diario de la primera semana para verificar una adecuada movilidad, el aseo y los hábitos alimenticios. </li><li> Los instrumentos quirúrgicos son limpiados con etanol y se inserta en el esterilizador de cuentas antes de la operación siguiente. </li><li> En el momento del sacrificio, los ratones se anestesian con pentobarbital sódico (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Cuando un plano de anestesia adecuado se logra, la cavidad torácica se abre. </li><li> Mientras el corazón sigue latiendo, una jeringa con una aguja de calibre 23, que contienen cloruro de potasio en frío (KCl, 30 mM) o 2,3-butanodiona monoxima (BDM, 10 mM) se utiliza para perforar la región basal posterior del ventrículo y la solución es se inyecta lentamente en la cámara hasta que el corazón es detenido en diástole. </li><li> Una vez que el corazón se retira, una jeringa que contenía PBS se utiliza para perfundir retrógradamente el corazón de enjuague para eliminar la sangre que queda. Para estudios de toxicidad aguda, al final del período de reperfusión, el muchacho se re-liga en el punto original de la oclusión. Una solución que contiene 1% de azul de Evans se inyecta en la aorta. Una vez que el corazón se extrae, se corta transversalmente en tres secciones de igual grosor, se incubaron en 1% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio, y la imagen de los análisis morfométricos 11. Para estudios de toxicidad crónica, el corazón se sumerge en el fijador, procesados ​​y embebidos de acuerdo a los procedimientos de rutina. Las diapositivas se pueden teñir histológicamente y con imágenes para el análisis morfométrico (con Scion, NIH Image J, o Image Pro Plus) 9,10,12. </li></ol> Los resultados representativos: Cuando se hace correctamente, las tasas de supervivencia en ratones (machos: 8-10 semanas de edad, 22-28g; mujeres: la edad de 10-12 semanas, 20-26g) son: más del 90% en aguda por isquemia / reperfusión isquémica y experimentos de precondicionamiento, en 85% en los estudios de la arteria ligadura permanente, y aproximadamente el 80% para inyección intramiocárdica. Desde temprana lesión es más fácilmente visible por los cambios metabólicos en lugar de la determinación estructural, el tamaño del infarto en la isquemia / reperfusión y la cardiopatía isquémica experimentos pre-acondicionamiento se realiza mediante la infusión de 1% de colorante azul de Evans en la aorta que perfundir el corazón que no es suministrado por la DA ( Figura 1 A). Una vez que el corazón y cortadas transversalmente por la mitad, el tejido se incuba en el 1% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio para medir el tamaño del infarto (fig. 1B). Las áreas se miden con Scion o NIH software de imágenes que puede ser calibrado usando un micrómetro de imágenes con el mismo aumento. Estos números se utilizan para calcular el área de riesgo / ventrículo izquierdo y el tamaño del infarto / área de riesgo 11. Diferencias de las cepas puede dar lugar a variaciones en el peso corporal y el tamaño del corazón y por lo tanto se debe tener cuidado para normalizar las medidas de peso del corazón, el peso corporal, o la longitud de la tibia con fines comparativos. Permanente resultados ligadura de la arteria en grandes cambios estructurales, tales como necrosis, adelgazamiento de la pared, y la dilatación de la cámara. La comparación de los efectos del tratamiento y / o tiempo en el tamaño del infarto y necrosis en relación con el ventrículo izquierdo, área de la cámara, y el espesor de la pared septal del ventrículo izquierdo de la pared libre en el modelo de oclusión permanente (Figura 2) también se puede medir con Scion o imágenes de NIH software. Tinción de colágeno con picrosirius rojo / verde rápido (Figura 2B) se puede utilizar para medir la fibrosis intersticial que se correlaciona con los índices funcionales de 8-10 rigidez de la pared. La imagen en la figura 3 se representa la distribución de la solución de 6ul (azul de Evans) se inyecta en la zona fronteriza del corazón después de la ligadura arterial permanente. Tenga en cuenta que procede en la dirección de la lesión, así como hacia la base y también transmural. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A. Evan &#39;s azul se inyecta en la aorta antes de la escisión. Esta imagen muestra las regiones de perfusión del corazón (manchado) y la zona ocluida (sin manchas). Evan B.&#39; s azul y manchas TTC siguientes efectos agudos de isquemia / reperfusión. Esta es una imagen representativa (20x) que muestra la distribución del colorante azul que se tiñe las regiones sin oclusión, así como la tinción de tejido viable TTC metabólicamente (rojo). Áreas necróticas no mancha y lo que se mantienen pálido (contorno). <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A. hematoxilina y eosina. Se trata de una imagen representativa (20x) de la tinción H &amp; E de un corazón de ratón cortada transversalmente a través de la región del infarto a los 4 días post-infarto (20x). * Denota la necrosis de los tejidos, las flechas apuntan al tejido de granulación, RV = ventrículo derecho y ventrículo LV = izquierda. B. Picrosirius rojo y verde rápido mancha. Este es unLa imagen (20x) de picrosirius rojo / verde tinción rápida de una sección transversal de corazón de ratón a las 4 semanas post-infarto de miocardio. El verde citoplasma manchas y fibras de colágeno son de color rojo. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Azul distribución del colorante de Evan mancha después de la inyección intramiocárdica 6ul. Esta es una imagen representativa que muestra la distribución global y transmural del colorante azul de Evans a través del corazón después de la inyección intramiocárdica 6ul en la zona de frontera inmediatamente después de la ligadura de la arteria coronaria (12x).

Este protocolo fue aprobado por los animales y está en conformidad con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la East Carolina University.

La enfermedad coronaria sigue siendo un método epidemiológico y fiscalmente problema de salud pública. La investigación básica sigue siendo considerable para comprender los mecanismos por los que las lesiones y remodelación proceder y cómo terapéuticos potenciales pueden modular estos procesos para que puedan ser desarrollados para su uso clínico. Los roedores son los más utilizados y la amplia gama de ratones modificados genéticamente, consigue de esta especie un modelo más atractivo. Aunque hay diferencias entre los ratones y otras especies, hay muchas ventajas para un modelo murino. El uso de un ámbito sencillo de disección o una lupa y las condiciones de buena iluminación permitirá a la vasculatura para ser visto con facilidad (por la anatomía detallada bruto de la vasculatura, véase Salto-Téllez et al., 2004 13). Para reducir el riesgo de mortalidad postoperatoria, es muy importante para evitar la ruptura de grandes vasos ya que el volumen total de sangre de un ratón de 25 g es menor de 2 ml 14. En el caso de que la hemorragia excesiva, aplicación suave de la presión o cauterización señalar se puede utilizar para detener el sangrado. Este procedimiento también puede ser modificado en una variedad de maneras. Por ejemplo, los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano, la ketamina / xilazina, o pentobarbital sódico y la selección apropiada es determinada por la duración del protocolo de 15-18. El reflejo de los pies-pinch es el índice más utilizado de la profundidad de la anestesia. Además, para mejorar la probabilidad de supervivencia a largo plazo, algunos investigadores utilizan fármacos antiarrítmicos como la lidocaína para reducir la incidencia de arritmias letales 19,20 sin embargo, debe tenerse en cuenta que este ha sido recientemente demostrado tener propiedades anti-apoptóticas en una aguda modelo 21. Además, para reducir el dolor postoperatorio, los analgésicos como la buprenorfina puede ser administrada durante las primeras 48 horas después de la cirugía 3,16,17,22,23. Para mantener la temperatura corporal durante la cirugía (especialmente para los más protocolos), una sonda rectal en serie con un cojín de la calefacción es a menudo usado en lugar de la almohadilla isotérmica. De la isquemia / reperfusión / o pre-isquémica o poscondicionamiento: la duración de la oclusión (s) y la reperfusión (s) puede ser alterado;; para oclusión permanente, el tamaño del infarto puede ser modificado mediante el ajuste de la ubicación de la ligadura y para inyección intramiocárdica (por ejemplo, células, proteínas), no puede haber lugares 1.3 de inyección y el volumen por inyección puede ser de hasta 15 l 24. Si las células se inyectan, el calibre de la aguja utilizada (usualmente 26-30) 5,25,26 deben ser elegidos con base en el tamaño de las células de modo que el diámetro interno de la aguja es lo suficientemente grande para evitar Sheering. Para evitar confunde debido a procesos inflamatorios provocados por la cirugía, algunos investigadores han reportado con una trampa que se manipula ex vivo para ocluir y reperfundir el corazón de un ratón de tórax cerrado en cualquier momento después de la cirugía 27-29. Más recientemente, Gao et al. 30 han demostrado que la oclusión temporal y permanente se puede realizar sin la necesidad de ventilación y algunos laboratorios han empezado a utilizar el ultrasonido para llevar a cabo a tórax cerrado intramiocárdica inyecciones 25,31. Desde el primer estudio que demuestra la viabilidad de la ligadura de la arteria coronaria en ratones fue publicado por Johns y Olson en 1954, de 32 años, muchos otros han adoptado este modelo y lo modificó para estudiar diversos aspectos de la lesión miocárdica y remodelación 3,33-45. La naturaleza de los ratones en términos de tamaño, capacidad de reproducción, y el costo relativamente menor para la compra y mantenimiento hacen que esta especie en una herramienta atractiva para una amplia gama de estudios fisiológicos y fisiopatológicos. A medida que la miniaturización de la tecnología para obtener imágenes de los avances en vivo 46-49, así como los medios para llevar a cabo y analizar la genómica y la proteómica a gran escala, la detección de drogas, la eficacia de las terapias basadas en células y / o proteínas, así como biomateriales 50-64, en combinación con el número cada vez mayor de las manipulaciones genéticas ofrecidas por todas partes o tejidos específicos de los ratones transgénicos o mutantes / octavos de final, el modelo murino de infarto de miocardio, sin duda, seguirá siendo una herramienta muy valiosa en la evaluación del daño cardíaco agudo y la remodelación a largo plazo. Por lo tanto, no es un valor incuestionable en el poder para llevar a cabo estos experimentos de forma fiable y reproducible.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Long Vanna Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-159</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; straight, 1x2 teeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scalpel handle #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-64</td>
<td>#10 sterile blade</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; half curved serrated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Castroviejo Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-1828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cook Eye Speculum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-63</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgipro II 8-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>VP-900-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolene 6-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>8776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Germinator 500 Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellpoint Scientific</td>
<td>65369-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deltaphase isothermal pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Braintree Scientific</td>
<td>39DP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe - 25&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge beveled needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7803-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ventilator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>TOPO</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

51.7K vistas.  East Carolina University. Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Video: Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para la ligadura de la arteria coronaria en ratones

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Investigación

Medicina

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Evaluación Ultrasonido base de la arteria coronaria de flujo y la reserva coronaria Utilizando la sobrecarga Modelo Presión en ratones

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by reduced blood supply to the heart, resulting in the loss of oxygen to and the ensuing necrosis of the heart muscle. The MI model has gained popularity for its use as a short-term ischemia-reperfusion model and a long-term permanent ligation model. Below, we describe a reliable method for the permanent ligation of the LAD. With mouse genetic engineering technology becoming more advanced, and with an increasing availability of quality murine surgical instruments, the mouse has become a popular model for MI surgeries. Our surgical model incorporates the use of an easily reversible anesthetic for the rapid recovery of the mouse; a minimally invasive endotracheal intubation without involving a tracheotomy; and a thoracentesis through the original thoracotomy site without creating an additional incision in the chest, as is done in some other methods, to effectively remove excess blood and air from the chest cavity. This method is comparatively less invasive than other methods, which dramatically reduces surgical and post-surgical complications and mortality and improves reproducibility.

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Murino descendente anterior (LAD) ligadura de la arteria coronaria: un modelo mejorado y simplificado para el infarto de miocardio

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Retraso en la administración intramiocardio de células madre después de la lesión por reperfusión de isquemia en un modelo murino

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Trasplante intramiocardio de hidrogeles inyectables msc-loading después de infarto de miocardio en un modelo murino

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...