El daño isquémico induce un ambiente proinflamatorio hostil que afecta la supervivencia de las células trasplantadas. Nuestro protocolo presenta un método alternativo para proporcionar productos biológicos eludiendo la respuesta inmunitaria inicial a la lesión. La principal ventaja de este protocolo es que permite administrar terapias una semana después de la lesión, imitando el tratamiento en el entorno clínico.
Nuestro enfoque principal es el modelo de lesión por reperfusión de isquemia y el trasplante de células STEM. Sin embargo, este enfoque también se puede utilizar para modelos de enfermedad inflamatoria que implica la introducción de terapias biológicas. Comience por autoclavar todos los instrumentos quirúrgicos.
Si se van a realizar varias cirugías en una sesión, limpie los instrumentos después de cada animal y vuelva a esterilizarlos con un esterilizador de cuentas calientes. Administrar por vía subcutánea analgésico, pesar al animal e introducir el peso en el ventilador. Afeitar el lado izquierdo del pecho desde el esternón hasta el nivel del hombro y aplicar crema depilatoria para eliminar el exceso de piel.
Para prevenir el colapso pulmonar, mantenga la presión espiratoria final positiva en dos centímetros de agua para el procedimiento de reperfusión de isquemia y cámbielo a tres centímetros de agua para el procedimiento de inyección tardía de células. Después de anestesiar el ratón, intubarlo con un tubo endotraqueal de calibre 20 y transferirlo a una almohadilla de calentamiento controlada para mantener una temperatura corporal de 35 a 37 grados Celsius. Coloque el ratón en la reclinación lateral con el extremo craneal a la izquierda y el extremo caudal a la derecha.
Frote el área quirúrgica alternando entre yodo povidona y hisopos de alcohol tres veces y aplique pomada oftálmica en ambos ojos. Utilice un bisturí de hoja número 10 para hacer una incisión vertical de 2,5 milímetros a la derecha del pezón más a la izquierda en el campo de visión, luego use tijeras para cortar a través de las capas musculares superficiales hasta que el músculo intercostal y las costillas sean visibles. Mientras levanta las costillas y el tejido circundante, corte el espacio intercostal entre la cuarta y la quinta costillas, luego inserte el retractor del párpado en el espacio abierto.
Retirar el pericardio usando fórceps curvos, moviendo el pulmón hacia arriba y fuera de la vista. Pasar una sutura de nylon 9-0 a través del miocardio debajo de la arteria LAD 2,5 milímetros distal a la aurícula izquierda manteniendo un movimiento suave y consistente para evitar el desgarro del tejido o perforar un vaso sanguíneo importante. Ate un nudo cuadrado suelto, luego coloque un centímetro de tubo de polietileno dentro del nudo suelto.
Asegure la sutura alrededor del tubo y confirme la isquemia por palidez y arritmia ventricular, luego suéltela después de 35 minutos. Después de retirar el tubo, espere cinco minutos para confirmar la refusión del miocardio. Coloque un tubo de catéter IV de calibre 24 en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura.
Utilice 6-0 suturas absorbibles para cerrar la incisión intercostal en un patrón interrumpido simple y la capa muscular en un patrón de sutura continua. Después de cerrar la capa muscular superficial, retire el tubo torácico mientras retira el aire de la cavidad torácica con una jeringa de tuberculina de un mililitro. Cierre la incisión de la piel con una sutura absorbible 6-0 en un patrón de colchón horizontal continuo.
Cuando haya terminado, administre 1,5 mililitros de solución salina caliente por vía subcutánea y aplique un pomada triple de antibióticos en el lugar de la incisión para prevenir la infección. Transfiera el ratón a una jaula libre de ropa de cama o a una jaula con ropa de cama cubierta en una almohadilla caliente y una temperatura de 35 a 37 grados centígrados hasta que esté completamente recuperado. Después de preparar e intubar el ratón como se describió anteriormente, retire la sutura de la capa de la piel con tijeras y fórceps, luego use un bisturí número 10 para hacer una incisión en el mismo lugar que la cirugía anterior.
Continúe cortando el tejido cicatricial hasta que la sutura de la capa muscular sea visible, luego use las tijeras y fórceps para eliminar la sutura y cortar la capa muscular abierta. Retire las suturas que sostienen las costillas juntas y continúe cortando a través del músculo intercostal de la incisión anterior. Coloque el retractor del párpado en el espacio intercostal y localice el área de la ligadura anterior.
Cargue 300.000 células STEM mesenquimales suspendidas en 20 microlitros de PBS en una jeringa de insulina de calibre 30 y doble la aguja ligeramente para lograr el ángulo de inyección adecuado. Moviéndose en la dirección desde el ápice hacia la base del corazón, inserte la jeringa en la región del peri-infarto hasta que la abertura de la aguja esté completamente dentro del miocardio, luego inyecte lentamente las células en el miocardio, espere tres segundos y retire la aguja. Observe el corazón de cerca durante tres minutos para asegurarse de que no hay ninguna reacción anormal a las células como la fibrilación ventricular.
Después de tres minutos, coloque un tubo de catéter IV de calibre 24 en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura. Cierre el músculo intercostal y las capas de la piel y retire el tubo torácico como se describió anteriormente. Administrar 1,5 mililitros de solución salina caliente por vía subcutánea y aplicar un pomada triple de antibióticos en el lugar de la incisión para prevenir la infección.
Transfiera el ratón a una jaula o jaula libre de ropa de cama con ropa de cama cubierta en una almohadilla caliente hasta que esté completamente recuperado. El ecocardiograma postoperatorio y el electrocardiograma se realizaron el día en que se estaba realizando la implantación de células STEM, confirmando el infarto y la disminución de la función contráctil ventricular. Un examen adicional de los datos mostró que la fracción de eyección y el acortamiento fraccionado disminuyeron en ratones que recibieron lesiones isquémicas, mientras que los volúmenes diastólicos y sistólicos finales aumentaron.
La tinción tricromática de Masson del tejido miocárdico siete días después de la lesión mostró un aumento de la deposición de colágeno y adelgazamiento de la pared ventricular izquierda en corazones de ratones que recibieron lesiones isquémicas. La imagen bioluminiscente in vivo o BLI se realizó al día siguiente de la implantación de células STEM mesenquimales. La entrega exitosa de MSC se ejemplifica con la señal BLI en comparación con los ratones que habían inducido lesiones por reperfusión de isquemia pero no recibieron MSC.
Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los pequeños movimientos intencionales al cortar a través de los intercostales, ligar el vaso, y las células de inyección son vitales para prevenir daños indebidos en el corazón o el pulmón en el campo de visión. Estos procedimientos ofrecen la capacidad de monitorear la función cardíaca después del trasplante a través de ultrasonido, viabilidad celular a través de imágenes de bioluminiscencia, o otras técnicas moleculares o bioquímicas dependiendo de la terapia utilizada.
