Agradecemos a Samuel Shepard, Bazeley Pedro y Juan David Bell para la administración de las páginas web de MRI Genómica. Este trabajo fue apoyado por la National Science Carrera premio de la Fundación &quot;La investigación de intrón funciones celulares&quot; [el número de concesión MCB-0643542].

Todos los programas que se utilizan en el documento se han escrito usando Perl, y todas las páginas web se han creado usando PHP. 1. Punto de partida: Abra la página principal del paquete en línea MRI Genómica http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / GMRI /. El recurso en la web también proporciona instrucciones / explicaciones sobre los programas de la &quot;Ayuda (How-to/README)&quot; que aparece, mientras que todos los materiales publicados en Genómica algoritmos de resonancia magnética y otras similares aparecen en la &quot;Enlaces a los recursos pertinentes&quot; enlace. 2. Preparación y carga de entrada de secuencia (s). Cree un archivo con formato FASTA-secuencia (s) para iniciar una sesión de análisis GMRI. Cada secuencia de nucleótidos en este formato debe ser precedido por una sola línea de partida con el carácter &quot;&gt;&quot; que representa un identificador, seguido en la misma línea con una breve descripción de esta secuencia. Las secuencias de nucleótidos para el análisis también permite GMRI personajes como R, S, N, X, etc Hwever, no-A, T, C, G personajes no serán procesados ​​por el programa y se evitará. Secuencias en las que los elementos repetitivos han sido &quot;enmascarado&quot; (por &quot;N&quot; s) se puede utilizar como entrada. Tenga en cuenta que los caracteres de la secuencia son mayúsculas y minúsculas. <ol><li> Inicie una sesión GMRI haciendo clic en &quot;Iniciar o reanudar&quot; el botón en la página principal de MRI Genómica. Esto lleva al usuario a una página donde las secuencias de nucleótidos se pueden cargar. </li><li> Copiar y pegar con formato FASTA secuencias o cargar un archivo que contiene las secuencias de su equipo local mediante el &quot;elegir archivo&quot;. </li><li> Haga clic en la &quot;nueva sesión comenzará con este archivo&quot;. Un mensaje de confirmación debe aparecer por encima de la ventana de entrada que indica que &quot;La secuencia se ha subido correctamente&quot; y también debe tener un carácter alfanumérico &quot;GMRI identificador&quot; [el sitio de la llama una &quot;etiqueta de sesión&quot;] de la sesión (por ejemplo, b16yMj), que se puede utilizar para recuperar y continuar una sesión de hasta dos semanas después del primer uso. </li></ol> NOTA: A partir de entonces las secuencias de entrada se conocen como &quot;userfile&quot;. 3. Obtener una distribución de frecuencias de oligonucleótidos de las secuencias de entrada (opcional). Haga clic en el &quot;Analizador de SRI&quot; (la fila de arriba) con el fin de obtener una distribución de frecuencias de oligonucleótidos para el conjunto de secuencias de entrada. El acrónimo SRI representa la falta de homogeneidad de corto alcance. En este momento, el usuario puede especificar la longitud máxima de oligonucleótidos (de 2 a 9 nucleótidos, por defecto 6 noches) para los que las frecuencias se calcula. Esta selección se realiza haciendo clic en la opción deseada en el cuadro &quot;Tamaño máximo de oligómero&quot; lista. A continuación, pulse el botón &quot;Analizar archivos&quot; para iniciar el cálculo. Una representación aproximada de la composición de la secuencia de entrada de inmediato aparecerá como una pequeña tabla en medio de esta página web y descargarse como &quot;userfile.comp.tbl&quot;. Esta tabla representa sólo los oligonucleótidos más y el menos abundante en las secuencias de entrada. La tabla de frecuencias para todos los oligonucleótidos posibles se genera un archivo llamado &quot;userfile.comp&quot;, que se puede obtener a través de la &quot;Descarga de archivos composición&quot; enlace. NOTA: SRI analizador cuenta el conjunto de todos los oligonucleótidos se superponen. 4. Generar secuencias aleatorias con la misma composición de oligonucleótidos Al igual que en las secuencias de entrada (opcional). (Finalización de la etapa 3 del protocolo es necesario para esta tarea). <ol><li> Haga clic en el &quot;Generador de SRI&quot; (la fila superior) para abrir una nueva página web que crea secuencias aleatorias. Elija el número de muestras de las secuencias al azar que se genera mediante el cuadro de lista en esta página web. Cada uno de estos archivos de muestra contendrá secuencias aleatorias de la misma cantidad y la duración de las secuencias de entrada en &quot;userfile&quot;. Por otra parte, si una secuencia de entrada contiene no-A, T, C, G o caracteres, la secuencia aleatoria se han &quot;N&quot; s exactamente en las mismas posiciones que en la secuencia de entrada. </li><li> Elija la más larga longitud de los oligonucleótidos de las frecuencias que se aproximan en las secuencias aleatorias. Esto puede ser elegido por comprobar el botón de radio para el nivel de oligómero deseado (por ejemplo, &quot;4-dores&quot; de oligonucleótidos de cuatro bases) en la mesa en el centro de la pantalla. Es de hacer notar que las secuencias aleatorias consistirá no sólo de las frecuencias aproximadas a nivel oligómero elegido, sino también las frecuencias correspondientes de los niveles de oligómeros más cortos, como en las secuencias de entrada. Pequeñas fluctuaciones en el oligonucleótidolas frecuencias de entrada y secuencias aleatorias son posibles debido al procedimiento de Markov Model aplicada para la generación de secuencias aleatorias. </li><li> Inicie el programa haciendo clic en la opción &quot;Generar Archivo&quot;. Si las secuencias de entrada son grandes puede tardar un par de minutos para generar secuencias aleatorias. Así, un usuario debe esperar hasta azul &quot;Download&quot; enlaces aparecen en la parte inferior de esta página. Los juegos de azar se encuentran en archivos con nombres como &quot;userfile.randX_Y&quot;, donde X es el número de la serie aleatoria e Y es el nivel de oligómero elegido (por ejemplo, &quot;userfile_rand2_4&quot;). </li></ol> 5. Análisis de la media en la falta de homogeneidad (MRI) de entrada y secuencias aleatorias. <ol><li> Haga clic en el &quot;Analizador de resonancia magnética&quot; (la fila superior), lo que abre una nueva página web que analiza la falta de homogeneidad de gama media de la composición de nucleótidos de las secuencias. </li><li> Seleccione una secuencia a analizar desde el &quot;Archivo de analizar&quot; cuadro de lista (a elegir entre la secuencia de entrada y establece generados de secuencias aleatorias se pueden hacer aquí). </li><li> Elija el tipo de contenido de la resonancia magnética que se analizó a través del cuadro de lista. (Siete opciones de contenido están disponibles: G + C, G + A, G + T, A, G, C, o T.) </li><li> Elija la longitud de la ventana para que las secuencias ricas en contenido y el contenido de los pobres-serán examinados a través del cuadro &quot;Tamaño de la ventana&quot; lista (por defecto es de 50 nucleótidos, el rango válido es de 30 a 1000). </li><li> Elegir el umbral superior e inferior de umbral de las regiones ricas en contenido y el contenido de los pobres, respectivamente. Estos umbrales se puede definir el número exacto de nucleótidos particular en la ventana actual (con la opción de número de la lista) o por el porcentaje de estos nucleótidos en la ventana (con la opción de porcentaje) </li><li> Después de las cinco opciones se han hecho (por ejemplo: Secuencia = &quot;userfile&quot;; Contenido = GC, tamaño de la ventana = 50; límite superior = 35; límite inferior = 15), abra el programa pulsando el botón Analizar archivos. El programa explora todas las secuencias de la entrada seleccionada en forma consecutiva. En cada paso se obtiene un segmento de la secuencia actual con una longitud igual al tamaño de la ventana especificada y calcula si el número o porcentaje de los nucleótidos del contenido seleccionado está por encima del límite superior o por debajo del umbral inferior. Si la ventana no coincide con cualquiera de los criterios, la siguiente ventana se superponen (cambiado por un nucleótido) es seleccionado para el mismo análisis. Cuando una ventana donde se encuentra la secuencia cumple uno de los requisitos mínimos de contenido-ricos o pobres en la composición, el programa guarda la secuencia de la ventana, en el archivo de salida y genera un aumento en la producción gráfica. Después de esto, el programa salta a la siguiente que no se superponen ventana adyacente y se reanuda el proceso de exploración hasta el final de la secuencia se alcanza. </li><li> Después de la finalización del programa, un vínculo al archivo de salida (con el nombre de &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; para el ejemplo anterior) y aparece una representación gráfica de los resultados se muestra en el centro de la página web (ver Figura 1). En esta pantalla gráfica de todas las secuencias de entrada de la userfile se concatenan en una sola cadena y se presenta como una línea horizontal negro en el eje X, con una longitud de kilobases (kb) se muestra a continuación. Todas las regiones ricas en contenido a lo largo de las secuencias de entrada están marcados en azul &quot;hacia arriba&quot; los picos, y el contenido de los pobres regiones como el rojo &quot;hacia abajo&quot; picos. El número total de ventanas de contenido rico y pobre de contenido, se muestran en parenthses en la leyenda en la parte inferior de esta figura (32 y 19, respectivamente). La figura sirve para ilustrar la abundancia relativa y la disposición de las regiones de resonancia magnética. Mientras tanto, los detalles específicos se presentan en el archivo de salida (ver Figura 3). En este archivo, todos los segmentos de la secuencia de nucleótidos que coinciden con el contenido-ricos o pobres-los criterios y sus coordenadas están disponibles para un usuario como una lista de acuerdo con sus posiciones consecutivas a lo largo del archivo de entrada. </li><li> Después de completar el análisis de resonancia magnética de la secuencia elegida, un usuario puede iniciar un nuevo proceso en la misma página web y hacer cambios a los parámetros y / o archivos de entrada. Por ejemplo, con el fin de examinar la muestra previamente generados al azar # 1 con los parámetros de resonancia magnética mismo, el usuario sólo tiene que cambiar el archivo a analizar y seleccionar la opción &quot;userfile_rand1_4&quot; archivo, y luego presione el botón Analizar archivos de nuevo. Un nuevo archivo y la pantalla gráfica remplazará la vieja. Los resultados y las cifras de todos los exámenes en cada &quot;sesión lable&quot; (GMRI identificador) se guardará y estará disponible durante dos semanas a partir de la última actividad. Con el fin de guardar los resultados / figdas de forma permanente, el usuario debe seleccionar la opción &quot;Descargar archivos&quot; ficha (fila superior) y descargar toda la sesión o archivos individuales, según sea necesario. </li><li> Con esta página web analizador de resonancia magnética que un usuario puede estudiar <ul><li> (G + C)-ricos y (A + T), las regiones ricas </li><li> Purina (A + G), ricos y pirimidina (C + T) las regiones ricas </li><li> Keto (G + T)-ricos y los aminoácidos (A + C) las regiones ricas </li><li> A las regiones ricas y pobres-A </li><li> G-regiones ricas y pobres-G </li><li> T-regiones ricas y pobres-T </li><li> C-ricos y pobres, las regiones C </li></ul></li><li> La última versión de Genómica resonancia magnética tiene una nueva opción para el estudio de las regiones ricas con las purinas (R) / pirimidina (Y) los patrones de alteración que pudieran formar Z-DNA conformaciones. En la actualidad, esta opción está disponible desde el enlace de &quot;Z-DNA&quot; y funciona en las mismas condiciones que otras regiones de resonancia magnética antes mencionados. Un usuario debe seleccionar los umbrales superior e inferior para el número de (RY + YR) dinucleótidos se superponen en la ventana de exploración. El programa produce una salida similar gráfica y un archivo de segmentos de ADN enriquecido o empobrecido por la alternancia de purinas y pirimidinas. La supuesta Z-DNA regiones debe ser altamente enriquecido por la alternancia de R / Y las bases (ver el comentario de F &amp; F 2011). </li></ol> 6. Programas adicionales en el paquete de Genómica resonancia magnética (opcional). El recurso de MRI genómica también tiene dos opciones avanzadas para la generación de secuencias aleatorias muy específicas. Están disponibles a través del &quot;Generador de resonancia magnética&quot; y &quot;Generador de CDS&quot; fichas de la fila superior. <ol><li> Generador de resonancia magnética crea secuencias aleatorias con la misma composición de oligonucleótidos como el archivo de entrada (similar al SRI generador). Sin embargo, además, secuencias aleatorias imitar un patrón particular resonancia magnética especificada por el usuario. Dentro de esta página web, el usuario debe especificar un cuadro de lista de un patrón particular de resonancia magnética para ser imitado. El cuadro de lista contiene todos los patrones que se han examinado en esta sesión por resonancia magnética analizador (por ejemplo, &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;). Una secuencia aleatoria generada con esta opción no tendrá la misma composición de oligonucleótidos que el archivo de entrada seleccionada y la misma GC-ricos y los pobres patrones de como se ve en &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;. </li><li> CDS generador se utiliza para la asignación al azar de las secuencias codificantes de proteínas. Conserva la misma secuencia de aminoácidos como la que codifica la entrada especificado por el usuario. Además, el programa mantiene el mismo codón sesgos y di-codón como se especifica en los usuarios puedan elegir la tabla de entrada. La versión en línea del generador de CDS también acepta una secuencia de la proteína como una entrada. Todas las demás opciones para el programa sólo se ofrecen a través de stand-alone scripts de Perl disponible para su descarga desde la página web Genómica MRI principal. </li></ol> 7. Resultados representante Este protocolo permite a los usuarios para estudiar la falta de homogeneidad de la composición de las secuencias de nucleótidos. Es importante destacar, que también apoya la generación de una variedad de secuencias al azar, con una composición de oligonucleótidos que se aproxima a una de las secuencias de entrada. Por lo general, las secuencias genómicas de los eucariotas complejos no son homogéneos en su composición, sino que representan un complejo mosaico de segmentos de secuencia enriquecida con nucleótidos en particular (por ejemplo, ricos en purina, (G + T)-rica, (A + T)-rica, etc.) Estos patrones de gama media escala (desde 30 hasta 1.000 pb) se visualizan en la salida gráfica del analizador de resonancia magnética que muestra seleccionada de contenido rico en segmentos como los picos superior azul y el contenido de los pobres como los segmentos más bajos picos rojos (ver Figuras 1 y 2). Normalmente, el número de las regiones que gran cantidad de contenido y el contenido de los pobres-en una secuencia natural (Figura 1) es del orden de veces mayor que el número de los mismos tipos de regiones en las correspondientes secuencias al azar (Figura 2) tener el mismo oligonucleótido composición. Estos segmentos de la secuencia de gama media con la falta de homogeneidad en la composición de nucleótidos pueden ser de interés para el usuario. Están disponibles en los archivos de salida Genómica resonancia magnética para una mayor investigación. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un ejemplo de la salida del analizador de resonancia magnética gráfica del paso 5.7. Los resultados han sido obtenidos en una muestra de 44 intrones humanos. Barras azules representan las posiciones de las regiones ricas en GC-a lo largo de estos intrones. Las barras rojas representan GC-pobre (o rica en AT) MRI regiones. El eje y contiene los umbrales superior e inferior para el tipo de contenido determinado. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. MRI de salida del analizador de la secuencia aleatoria &quot;userfile.rand1_4&quot;. El gráficamentecal representación de la resonancia magnética dentro de una secuencia aleatoria generada con el programa generador de SRI. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un ejemplo de los principios de un archivo de salida de texto de analizador de resonancia magnética. Todas las secuencias ricas en contenido y el contenido de los pobres detectados por el programa se presentan en el último (cuarto) de la columna. Su posición relativa, medido en el número de ventanas, se muestran en la primera columna. La segunda y tercera columnas son los indicadores para las regiones ricas en contenido y el contenido de los pobres, respectivamente.

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

Regiones con una composición no homogénea de nucleótidos en las escalas de gama media (30 a 1000 nucleótidos) son sobreabundantes en los genomas de eucariotas complejas y se pueden encontrar en cualquier lugar (regiones intergénicas, intrones, regiones no traducidas de los exones, elementos repetitivos). Estas regiones se asocia con frecuencia a las conformaciones de ADN extraño. Por ejemplo, las secuencias de purine-/pyrimidine-rich tienden a formar tríplex de ADN (H-DNA), con la alternancia de secuencias de purina / pirimidina se asocian a Z-DNA conformaciones; (G + C) regiones ricas presentan anomalías estructurales en el B- ADN y podrían ser propensos a la ruptura columna vertebral, (A + T)-regiones ricas podrían formar una estructura inusual - un elemento de la anulación de ADN, etc (revisado por Fedorov y Fedorova 2010). Algunos de estos modelos de gama media (por ejemplo, (G + T)-regiones ricas) se no se ha investigado y aún esperan minuciosa exploración y reconocimiento. El objetivo principal de nuestro recurso Genómica web RM es ayudar a los usuarios en la identificación de estas regiones de resonancia magnética para su análisis experimental más allá y para la exploración de sus posibles funciones. El conocimiento de las regiones de la RM puede ser incorporada y mejorar la nueva generación de programas de predicción de genes (Shepard 2010) y avanzar en nuestra comprensión de las funciones y propiedades del genoma.

<ul><li> Ordenador con Internet </li><li> Los archivos con las secuencias de nucleótidos para el examen. </li></ul>

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

Regiones no codificantes genómica en eucariotas complejas, incluyendo las zonas intergénicas, intrones, y los segmentos no traducidos de los exones, son profundamente no-aleatorio en su composición de nucleótidos y se componen de un mosaico complejo de patrones de secuencia. Estos modelos incluyen los llamados Tres homogeneidad (MRI) regiones - 30-10000 secuencias de nucleótidos de longitud que se enriquecen con una base o de una combinación de bases (por ejemplo, (G + T)-ricos, ricos en purina, etc ). Regiones RM están asociados con estructuras de ADN extraño (no-B-forma), que a menudo están involucrados en la regulación de la expresión genética, la recombinación, y otros procesos genéticos (Fedorova y Fedorov 2010). La existencia de un sesgo fuerte fijación en las regiones MRI contra las mutaciones que tienden a reducir su falta de homogeneidad de secuencias, además, compatible con la funcionalidad y la importancia de estas secuencias genómicas (Prakash et al. 2009). Aquí se demuestra un recurso de Internet de libre acceso - el paquete de Genómica programa MRI - (. Bechtel et al 2008) diseñado para el análisis computacional de secuencias genómicas con el fin de encontrar y caracterizar diferentes patrones de resonancia magnética en su interior. Este paquete también permite la generación de secuencias al azar con diferentes propiedades y el nivel de correspondencia con las secuencias de ADN natural de entrada. El objetivo principal de este recurso es facilitar el examen de las vastas regiones de ADN no codificante que aún no se ha investigado y esperar minuciosa exploración y reconocimiento.

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Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Se presenta un sitio web público de computación para el análisis de secuencias genómicas. Se detecta patrones de secuencias de ADN con varias organizaciones no-aleatorio composiciones de nucleótidos. Este recurso también genera secuencias al azar, con diversos niveles de complejidad.

Genómica resonancia magnética - un recurso público para el estudio de patrones de secuencia en el ADN genómico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K vistas.  University of Toledo Health Science Campus. Se presenta un sitio web público de computación para el análisis de secuencias genómicas. Se detecta patrones de secuencias de ADN con varias organizaciones no-aleatorio composiciones de nucleótidos. Este recurso también genera secuencias al azar, con diversos niveles de complejidad.

Video: Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Investigación

Biología

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Transformación de Genómica de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Un método práctico y novela para extraer el ADN genómico de los kits de extracción de sangre para la Preservación Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...