La pirosecuenciación es una técnica de secuenciación por síntesis que se puede utilizar para genotipar polimorfismos de nucleótido único en el ADN mitocondrial. Este método es ventajoso en su facilidad de implementación y rentabilidad en comparación con otros métodos de secuenciación. Se puede utilizar fácilmente como método de diagnóstico para ciertas enfermedades mitocondriales mediante la determinación de valores de heteroplasmia de variantes patogénicas en el ADN mitocondrial.
Para comenzar, obtenga un archivo de secuencia de ADN mitocondrial para la especie que se está genotipando e identifique la posición del polimorfismo de nucleótido único, o SNP. Asegúrese de que la secuencia de referencia utilizada emplea la numeración de base adecuada para la mutación estudiada, de modo que la posición del SNP pueda identificarse fácilmente. Copie 1.000 pares de bases aguas arriba y aguas abajo del sitio SNP y pegue la secuencia truncada en el software de diseño de imprimación de pirosecuenciación.
Resalte la base polimórfica, haga clic con el botón derecho sobre ella y, a continuación, seleccione Establecer región de destino para establecer la base SNP analizada como el objetivo del ensayo de pirosecuenciación. Presione el icono Play en la esquina superior derecha de la interfaz para iniciar la selección del cebador y espere a que el software genere automáticamente los tríos de cebadores, dos cebadores para la preamplificación del ADN de la plantilla y el tercer cebador para la secuenciación por la síntesis en la máquina de pirosecuenciación. Haga clic con el botón derecho y seleccione Copiar todos los juegos de imprimación para conservar todos los juegos de cebadores.
Abra el software de ejecución suministrado con el pirosecuenciador, seleccione Nuevo ensayo y, a continuación, seleccione la plantilla de ensayo de cuantificación de alelos. Introduzca la secuencia a analizar en el cuadro correspondiente escribiendo los nucleótidos directamente aguas abajo del cebador de secuenciación. Para la posición variable, denote las dos bases posibles, separadas por una barra.
Presione Generar orden de dispensación y deje que el software determine automáticamente un orden adecuado para que los nucleótidos se dispensen en la secuenciación por reacción de síntesis. Guarde y proporcione un nombre para el ensayo. A continuación, ejecute la ejecución diluyendo el ADN a analizar a 5 nanogramos por microlitro.
En la primera ejecución, asegúrese de incluir muestras de heteroplasmia conocida como referencia y muestras de tipo salvaje. Luego realice una PCR de presecuenciación de 5 microlitros de ADN diluido y 25 microlitros de reacciones, utilizando los cebadores de amplificación y los parámetros. Para ejecutar la configuración del archivo, seleccione Nueva ejecución en el software del pirosecuenciador.
El pirosecuenciador puede secuenciar simultáneamente 48 reacciones preamplificadas separadas con un cuadrado vacío que representa un solo pozo de secuenciación en un disco de pirosecuenciación. Cargue los ensayos haciendo clic con el botón derecho en un cuadrado y seleccionando Cargar ensayo. Si es necesario, secuencie hasta cuatro ensayos separados con diferentes cebadores de secuenciación.
Establezca el modo de dispensación de cebador en automático para asignar automáticamente una cámara de inyección para cada cebador de secuenciación utilizado para la ejecución. Establezca el modo de ejecución en estándar, a menos que ejecute cuatro tipos diferentes de ensayos en un disco de secuenciación. Asegúrese de que el número de ensayos en el archivo de plantilla de ejecución coincida con el número de reacciones de PCR que se amplifican.
A continuación, guarde los archivos de ejecución en una unidad USB. Para preparar el pirosecuenciador, presione el botón de limpieza en la pantalla táctil principal del dispositivo y limpie todos los inyectores con agua de alta pureza, siguiendo las instrucciones en la pantalla. Al insertar la tira absorbente en la máquina, asegúrese de que los extremos se encuentren en la posición de las 9 en punto.
Después de conectar la memoria USB, presione el botón Secuencia para cargar los archivos de ejecución preparados anteriormente. Siga las instrucciones del dispositivo para cargar y cebar los reactivos, según sea necesario, en los inyectores correspondientes de la máquina. Cargue 3 microlitros de perlas en los pozos y luego cargue 10 microlitros de cada reacción de PCR para secuenciarla en la muestra correspondiente.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar la muestra con las perlas magnéticas. Busque la indicación en el pirosecuenciador cebado de que el disco se puede cargar en la máquina. Desenrosque la tuerca de sujeción de la placa y alinee la placa de muestra cargada con el pasador de metal en el compartimiento del disco.
Una vez que la placa esté firmemente atornillada en el compartimento de la placa, inicie la ejecución de secuenciación presionando el botón de inicio en la interfaz de la pantalla táctil. Una vez completada la ejecución, retire la unidad USB de la máquina y vuelva a conectarla a la computadora que ejecuta el software del pirosecuenciador. Después de que el archivo de ejecución recién generado aparezca en la unidad USB, haga doble clic en el archivo Run Result.
Esto analiza automáticamente la producción de luciferasa de cada pozo tras la incorporación de nucleótidos, y cuantifica el alelo mitocondrial de interés. Busque las puntuaciones de color mostradas por el software en función de la calidad de las lecturas. Para guardar los resultados, seleccione Informes en la ventana superior, seguido de Informe completo para generar un archivo PDF que contenga los pirogramas y los resultados de cada pozo de la carrera.
Como alternativa, descargue los resultados en otros formatos en la pestaña Informes. Electroforesis en gel de agarosa de una amplificación por PCR utilizando los cebadores de amplificación de ambos conjuntos seleccionados para la mutación m. 3243A>G como se muestra en esta figura.
Aquí, Het denota la muestra casi homoplásmica m. 3243A>G a analizar. En esta figura se muestra una comparación del rendimiento de ambos conjuntos de cebadores utilizando patrones molares para la calibración.
Los valores medidos se denotan mediante las líneas punteadas verticales. Se muestra una función lineal X=Y para ilustrar qué tan cerca está cada uno de los dos ensayos probados de una medición ideal. Los nombres de las líneas celulares en el eje X son los nombres de los diversos clones cíbridos que fueron genotipados usando este ensayo.
Los resultados del genotipado en cuatro clones cíbridos de heteroplasmia m. 3243A>G desconocida utilizando ambos ensayos se muestran aquí. La secuenciación se realizó por triplicado técnico.
Aquí se muestran los resultados de genotipado de células tratadas con nucleasa de dedos de zinc mitocondriales, junto con controles no tratados y tratados simuladamente, y los pirogramas de dos réplicas de PCR de muestras de células MEF utilizadas para generar los resultados, así como el control de genotipado de tipo salvaje. La pirosecuenciación se puede utilizar como una lectura para experimentos de terapia génica para evaluar diversas tecnologías de terapia génica en el ADN mitocondrial.
