El trabajo apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 de investigación principal, y las IES. Su contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente la posición oficial del NIH o instituciones de educación superior. Los autores declaran no tener ningún conflicto existentes o potenciales de interés.

1. El aislamiento de OHCS <ol><li> Iniciar este procedimiento por la extracción de los huesos temporales cobayas, ratones o su modelo de mamíferos. </li><li> A continuación, abra los huesos temporales utilizando una pinza de martillo con el fin de exponer a la cóclea, y sumérgelas en Leibovitz L-15. Eliminar el exceso de hueso con cuidado, manteniendo la cubierta ósea intacta. Considerando que este es un procedimiento general aplicable a los huesos temporales de otras especies de mamíferos, pequeños cambios en la técnica puede ser necesaria cuando se trata de huesos temporales de animales muy pequeños. En los animales viejos de la bulla es generalmente calcificadas, la introducción de una complicación adicional para el procedimiento. </li><li> Bajo observación microscópica, abra la región apical de la cóclea y eliminar estría vascular y el ligamento espiral con la punta de una hoja de bisturí # 11, un punto de recogida micro y una pinza fina. </li><li> Tome el órgano de Corti fuera del modiolo coclear con la pinza, y lo puso en la colagenasa 1mg/ml en L-15 a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Si OHCS de vueltas basal de la cóclea se necesitan, retire la cubierta ósea que cubre la base de la cóclea con la selección, y separar el espiral del hueso temporal con el bisturí antes de retirar el órgano de Corti. </li><li> Transferir el órgano de Corti a la cámara de grabación utilizando una jeringa de 50 l Hamilton. Después, se disocian las células por el reflujo a través de la aguja. </li></ol> 2. La instalación experimental <ol><li> Esquema de la alternancia de campo eléctrico externo (EAEF) del generador y su vinculación con el sistema de captura de la imagen (Fig. 1). El circuito de control se llevó a cabo especialmente en el Centro de Ingeniería de la House Ear Institute. </li><li> El montaje experimental utilizado en nuestros experimentos se compone de un microscopio Axiovert 135TV invertido (Zeiss, Thornwood, NY) con un sistema de iluminación alternativo basado en LED (LED de alta potencia del sistema 36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dos micromanipuladores electrónico (Eppendorf &quot;PatchMan&quot;, Alemania), controlado por PC ultra-alta velocidad Photron FastCam X 1024 PCI cámara (Photron Inc. EE.UU.) en el puerto de Keller y una cámara CCD más regulares en el puerto trinocular. La cámara FastCam es capaz de captar imágenes a frecuencias altas (hasta 100.000 fps) y alta resolución (por ejemplo, 1024 x 1024 píxeles a 1000 fps, 512 x 128 a 10.000 fps, 384 x 96 a 18.000 fps, y así sucesivamente). Las imágenes proporcionadas por la cámara de alta velocidad son observadas directamente en el monitor del PC, mientras que la cámara CCD está conectada a un monitor diferente. El sistema de iluminación LED, trabaja en dos modos distintos: analógico de baja potencia y alta potencia digital. Todos los procedimientos preliminares (colocación de electrodos, la colocación de células, el enfoque, etc) se realizan utilizando el modo analógico de baja potencia. La iluminación de alta potencia se activa por la apertura del obturador de la cámara y luego apagado por el cierre del obturador, lo que facilita la disipación del calor. Software casero, también desarrollado en la Casa central del oído Instituto de Ingeniería, que se ejecutan en el mismo PC controla el disparador de la cámara de alta velocidad, el sistema de iluminación basados ​​en LED, y la EAEF. Una cámara de fotos digital convencional en el puerto frontal permite imágenes fijas como sea necesario. (Fig. 2 A). </li><li> Electrodos (dos 0,25 mm de diámetro con una distancia de los cables de Ag punta de 0,8 mm) se ven obligados a utilizar la posición de uno de los micromanipuladores electrónico. Posición de los electrodos es monitoreado de forma visual ya través de la imagen microscópica, un cambio en el plano focal de la imagen indica que los electrodos tocó el fondo de la cámara experimental. Inicialmente, el campo eléctrico se calibra con un electrodo externo. Este electrodo mide el potencial eléctrico en diferentes puntos, lo que genera un &quot;mapa&quot; del campo eléctrico. Si una sola célula aislada ciliadas externas se coloca entre las puntas de los electrodos con su eje longitudinal paralelo a la EAEF aplicada, se moverá alargar y acortar a la misma frecuencia del campo eléctrico. Si la célula se coloca perpendicular al campo un tipo diferente de respuesta OHC (flexión) puede ser observado e investigado. (Fig. 2 B) </li></ol> 3. EAEF la estimulación y la captura de imágenes <ol><li> Cuatro protocolos de estimulación se pueden seleccionar diferentes (Fig. 3): <ol><li> continua de frecuencia única (Fig. 3 A). Tenga en cuenta que el tipo de modo de estímulo, frecuencia, amplitud de onda y se pueden seleccionar con el hecho en casa de software de control (círculos rojos). </li><li> frecuencia irrumpió sola (Fig. 3 B). La longitud de las ráfagas y las diferencias entre estalló también seleccionables. </li><li> barrido lineal (Fig. 3 C). Las frecuencias iniciales y finales son seleccionables. </li><li> multi-estimulación (Fig. 3 D). Una sola frecuencia y barridos lineales se pueden combinar en un solo experimento. Después de seleccionar los parámetros correspondientes, el software de control se configura el sistema y permite al operador para iniciar la luz la grabación sincronizada de vídeo y la estimulación de células haciendo clic en un botón enla pantalla del ordenador. </li></ol></li><li> Las imágenes se capturan en formato AVI para su posterior análisis en las frecuencias altas. </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> En esta película, dos células ciliadas externas aisladas muestran cambios en la longitud o la curvatura cuando son estimulados con un campo externo eléctrica alterna que es paralela o transversal, respectivamente, a su eje longitudinal. (Película # 2). </li><li> Respuestas OHCS móviles son analizadas off-line mediante el software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). &quot;Característica de seguimiento&quot; en función de este software proporciona la distancia entre dos puntos de cuadro por cuadro (Fig. 4). Durante celular acortando la distancia entre los puntos seleccionados en el vértice (placa cuticular, color rojo) y la base de la célula (polo basal, de color verde) es más pequeño, y aumenta con la elongación celular. La película muestra el software de análisis cuadro por cuadro los cambios en la longitud. El panel en la parte inferior de la imagen muestra la huella del movimiento. En este ejemplo, el cambio total de longitud es de 6,5 píxeles. </li><li> &quot;Adaptación al suelo&quot; en función de software ProAnalyst puede detectar automáticamente borde de la celda y medir el área de la sección óptica (Fig. 5). </li><li> Microesferas de poliestireno a la solución de baño de forma aleatoria y firmemente se adhieren a la membrana plasmática (Fig. 6 A). Diferentes microesferas se pueden seleccionar de forma simultánea y automáticamente el software puede rastrear todos ellos fotograma a fotograma. De esta manera, las células se pueden dividir en secciones y la motilidad de cada sección evaluada de forma independiente. (Fig. 6 A) </li><li> Mediante la selección de las microesferas se encuentra en los bordes laterales de la imagen de la célula, los cambios en la longitud de cada segmento y los cambios en el ángulo del respeto de un segmento a otro (flexión) también puede ser evaluado independientemente. (Fig. 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama del generador EAEF y sus vínculos con el sistema de captura de imágenes. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A) Imagen de la instalación experimental. B) Detalle de la platina del microscopio, con caricaturas de los electrodos y una sola OHC colocado entre ellos, con su eje longitudinal paralelo al campo eléctrico. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Una interfaz de usuario) del software de control de fabricación casera configurado para una sola frecuencia de estimulación. Los parámetros seleccionados son un círculo rojo. B) La interfaz de usuario de la fabricación casera de software de control configurado para la estimulación del estallido de una sola frecuencia. C) Interfaz de usuario de la fabricación casera de software de control configurado para la estimulación de barrido lineal. D) Interfaz de usuario del software de control de fabricación casera configurada para multi-estimulación. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Fotograma de una OHC con dos puntos seleccionados en la base (verde) y el vértice (rojo) de la célula, respectivamente, utilizando la &quot;función de seguimiento de&quot; la función del software ProAnalyst. La curva debajo de la celda muestra los cambios periódicos en la distancia entre los puntos seleccionados relacionados con la estimulación eléctrica. Traslado de la barra de diferentes marcos verticales pueden ser seleccionados para el análisis individual. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. La &quot;adaptación al suelo&quot; en función de ProAnalyst detecta el borde de la celda y automáticamente medir el área de la sección óptica. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Una imagen) capturados de una OHC aislados decorado con microesferas de poliestireno (arriba), y la misma imagen con cinco microesferas seleccionadas individualmente (abajo). Un color se le asignó a cada microesfera, y sus desplazamientos pueden ser individualmente y de forma automática el marco seguimiento por imagen, analizadas y comparadas. B) Los segmentos de longitud arbitraria se puede definir mediante la selección de microesferas de poliestireno se encuentra en los bordes de la celda, y los cambios en la longitud de estos segmentos, así como cambios en la orientación de un segmento respecto a los demás (células de flexión) puede ser evaluado de forma automática el marco de marco con el software de análisis de imagen. Movie 1. Aislamiento de Indias OHCS cerdo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> Movie 2. OHCS paralela y perpendicular a la EAEF mostrando electromotility típicas y las respuestas de flexión. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Haga clic aquí para ver el video</a>

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	<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells.">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+motility.">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li><li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin,+a+new+type+of+motor+protein.">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field.">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells.">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells.">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+cochlear+amplifier.">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li><li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field.">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li><li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+outer+hair+cell+motility:+corrections+and+addendum.">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li><li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells.">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility:+effects+of+the+membrane+filter.">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy. , (1986).</li></ol>

El método experimental que aquí se presenta permite estimar las respuestas OHC móviles en el rango de kHz sin ningún tipo de restricción al movimiento de la célula. Diferentes protocolos de estimulación, marcadores adicionales (microesferas), así como los cambios en la orientación de la celda con respecto al campo eléctrico, hacen que sea posible investigar nuevos aspectos de la motilidad OHC con un nivel de detalle que antes eran inaccesibles. Otros métodos, como por ejemplo los que utilizan fotodiodos ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa (Tipo 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/ml en L-15 </td></tr></tbody></table>

investigating outer hair cell motility with a combination of external alternating electrical field stimulation and high-speed image analysis

OHCS son cilíndricas células sensoriomotora situado en el órgano de Corti, el órgano de la audición en el oído interno de mamíferos. El nombre de &quot;células ciliadas&quot; deriva de su paquete de características apical de los estereocilios, un elemento crítico para la detección y transducción de energía de sonido 1. OHCS son capaces de cambiar de forma alargada, se acortan y doblar-en respuesta a la estimulación eléctrica, mecánica y química, una respuesta motora se considera crucial para la amplificación de las señales acústicas coclear 2. Estimulación induce OHC dos respuestas diferentes móviles: i) electromotility, la motilidad rápida aka, cambios en la longitud en el rango de microsegundos derivados de propulsión eléctrica, cambios conformacionales en proteínas motoras densamente empaquetadas en OHC membrana plasmática, y ii) la motilidad lenta, los cambios de forma en el milisegundos a segundos amplia participación de la reorganización del citoesqueleto 2, 3. OHC flexión se asocia con electromotility, y el resultado tanto de una distribución asimétrica de proteínas motoras en la membrana plasmática lateral, o la estimulación eléctrica asimétrica de las proteínas de motor (por ejemplo, con un campo eléctrico perpendicular al eje longitudinal de las células) 4. Estímulos mecánicos y químicos inducen respuestas móviles esencialmente lenta, a pesar de los cambios en las condiciones iónicas de las células y / o su entorno también puede estimular la membrana plasmática incrustado proteínas motoras 5, 6. Dado que las respuestas OHC móviles son un componente esencial del amplificador coclear, el análisis cualitativo y cuantitativo de esas respuestas en las frecuencias acústicas móviles (aproximadamente desde 20 Hz a 20 kHz en los seres humanos) es un asunto muy importante en el campo de la audición de investigación 7. El desarrollo de nueva tecnología de imágenes que combina alta velocidad de cámaras de video, los sistemas de LEDs de iluminación, y un sofisticado software de análisis de imagen ofrece ahora la posibilidad de realizar estudios cualitativos y cuantitativos fiables de la respuesta de los móviles OHCS aislado a un campo externo eléctrica alterna (EAEF) 8. Esta es una técnica sencilla y no invasiva que evita la mayor parte de las limitaciones de los enfoques anteriores 9-11. Por otra parte, el sistema de iluminación basados ​​en LED proporciona brillo extremo con insignificantes los efectos térmicos de las muestras y, debido a la utilización de la microscopía de vídeo, resolución óptica es de al menos 10 veces mayor que con las técnicas convencionales de microscopía de luz 12. Por ejemplo, con el montaje experimental se describe aquí, los cambios en la longitud de la célula de alrededor de 20 nm puede ser rutinaria y detectar con seguridad en las frecuencias de 10 kHz, y esta resolución puede mejorarse aún más en las frecuencias más bajas. Estamos seguros de que este enfoque experimental ayudará a ampliar nuestra comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la motilidad OHC.

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Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Un método fiable para investigar células ciliadas externas (OHC) las respuestas de móviles, incluyendo electromotility, motilidad lenta y flexión, se describe. Motilidad OHC es provocado por la estimulación con un campo externo eléctrica alterna, y el método tiene la ventaja de la grabación de imágenes a alta velocidad, la iluminación basada en LED, y el software de última generación de imágenes de análisis.

La investigación de la motilidad células ciliadas externas, con una combinación de la estimulación externa alterna de campo eléctrico de alta velocidad y Análisis de Imágenes

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K vistas.  House Ear Institute. Un método fiable para investigar células ciliadas externas (OHC) las respuestas de móviles, incluyendo electromotility, motilidad lenta y flexión, se describe. Motilidad OHC es provocado por la estimulación con un campo externo eléctrica alterna, y el método tiene la ventaja de la grabación de imágenes a alta velocidad, la iluminación basada en LED, y el software de última generación de imágenes de análisis.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Uso del protocolo Theta-Burst para explorar Mechasnism de plasticidad en los individuos con el síndrome de X frágil y el autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Investigación

Neurociencias

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

A-máquina humana integración de sensores de bajo coste con un sistema de estimulación eléctrica neuromuscular para la Rehabilitación de Balance post-accidente cerebrovascular

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Evaluación de la función neuromuscular Usando percutánea estimulación nerviosa eléctrica

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Imágenes de vídeo y mapas espacio-temporales para Analizar la motilidad gastrointestinal en ratones

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Efectos de la corriente alterna la estimulación transcraneal en la corteza de Motor primaria por Online enfoque combinado con la estimulación magnética transcraneal

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Estimulación eléctrica transcraneal crónica y grabación Intracortical en ratas

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...