Esta práctica puede ayudarnos a estudiar los cambios dinámicos de los componentes nano estructurales de la maquinaria de transducción eléctrica mecánica en la superficie de los haces de estereocilios de células ciliadas. La principal ventaja de esta técnica es la obtención de imágenes de lapso de tiempo de la superficie de células vivas con topografía compleja a una resolución de un solo nanómetro, y sin hacer contacto físico con la muestra. Esta técnica se puede aplicar a casi cualquier célula viva.
Anteriormente emparejamos la superficie de las líneas celulares epiteliales pulmonares infectadas con virus, células musculares, en My Image Bacteria Soon. Pruebe las nanopipetas al comienzo de cada sesión de imágenes. Después de fabricar una nanopipeta, verifique si hay burbujas, elimine las burbujas si están presentes y monte la nanopipeta en el soporte de pipeta del microscopio de conductancia iónica de la sonda de salto.
A cuatro mililitros de baño, la solución a la cámara y colocar la cámara en el escenario HPICM. Introduzca el electrodo de tierra en la solución de baño y asegúrese de que el voltaje que se aplica a la pipeta a través del amplificador de abrazadera de parche sea cero. Después de colocar el micromanipulador en la posición vertical, mueva la pipeta en Z hasta que toque el líquido y ajuste el desplazamiento del amplificador a cero, antes de agregar más 100 milivoltios para verificar la corriente de la pipeta.
Utilice pegamento de silicio para conectar el estándar de calibración AFM a la cámara y cubra la muestra con cuatro mililitros de HBSS. Utilice cinta de doble cara para asegurar la cámara a la etapa X Y de la configuración de HPICM y cargue una nueva nanopipeta en el soporte como se ha demostrado. Después de probar la resistencia y el diámetro de la nanopipeta, ajuste la corriente a un nano amperios.
Utilice un manipulador de abrazadera de parche grueso para colocar la nanopipeta aproximadamente por encima del centro del estándar de calibración y aumentar el punto de ajuste mientras monitorea la señal del sensor del actuador piezoeléctrico Z en un osciloscopio en tiempo real. Después de establecer un ciclo de aproximación Z repetible estable, disminuya el punto de ajuste al valor justo por encima del punto de inestabilidad y mueva la pipeta hacia abajo a una velocidad de aproximadamente cinco micras por segundo, hasta que llegue a la muestra. El nivel inferior de la señal de posicionamiento Z en tiempo real aumentará, lo que indica que la nanopipeta se retira debido a la detección de la superficie de la muestra.
Debido al montaje desigual en el estándar AFM, el punto más alto del área de interés puede ser desconocido. Por lo tanto, establezca la amplitud de la retracción de la pipeta en al menos 200 a 500 nanómetros. Teniendo cuidado de no exceder el límite superior del movimiento del actuador piezoeléctrico Z, comience a tomar imágenes a baja resolución.
Una vez que se haya identificado el punto más alto de la muestra en el área de imagen, disminuya la amplitud del salto y retraiga la pipeta aproximadamente 200 micras a lo largo del eje Z para evitar cualquier colisión no deseada con la muestra antes de moverla a una nueva ubicación X Y. Cuando se haya localizado el área de interés, comience a tomar imágenes a una resolución más alta. Para las imágenes auditivas de células ciliadas, asegure firmemente un órgano recién aislado de Corti a una cámara utilizando hilo dental o pipetas de vidrio flexibles.
Use cinta adhesiva de doble cara para asegurar firmemente la cámara a la etapa piezoeléctrica X Y y cargue una nueva nanopipeta en el soporte como se ha demostrado. Después de verificar la resistencia de la nanopipeta, use el micromanipulador de abrazadera de parche para colocar la nanopipeta sobre la región de las células ciliadas mientras observa el órgano de la planta Corti X en un microscopio invertido. Registre, la señal de corriente en tiempo real y de posicionamiento Z en el osciloscopio para verificar si el sistema es estable con un punto de ajuste de 0.5%6or inferior, y determinar el punto de ajuste óptimo y acercarse a la muestra como se demuestra.
Realice imágenes de baja resolución de la muestra, como se demostró utilizando una amplitud de salto de al menos seis a ocho micras. Si la nanopipeta necesita moverse a una nueva ubicación X Y, retraiga la pipeta unos 500 nanómetros para evitar una colisión con cualquier característica alta dentro del tejido y repita las imágenes HPICM de baja resolución hasta la región de interés donde se encuentran las células ciliadas. A continuación, imagine la región de interés a una resolución más alta en 15 minutos o menos.
El protocolo HPICM se puede utilizar para visualizar cualquier célula viva con una topografía compleja, como los haces de células ciliadas auditivas de ratas vivas. A pesar de demostrar una resolución X Y más baja en comparación con las imágenes de microscopía electrónica de barrido, las imágenes HPICM pueden resolver con éxito las diferentes filas de estereocilios. La forma de los estereocilios se inclina e incluso los pequeños enlaces de cinco nanómetros que conectan los estereocilios adyacentes.
Dada la naturaleza sin contacto de las imágenes HPICM, se pueden realizar imágenes continuas de lapso de tiempo del mismo haz de células ciliadas durante varias horas sin dañar la cohesión del paquete. Tenga en cuenta que con un punto de ajuste muy bajo, el sistema podría interpretar pequeñas fluctuaciones en la corriente como si se encontraran con la superficie de la celda, lo que provocaría un ruido de puntos blancos en la imagen. Del mismo modo, las grandes amplitudes de salto pueden aumentar la resonancia lateral de la pipeta, lo que también resulta en la producción de píxeles ruidosos.
Por el contrario, si la amplitud del salto es demasiado pequeña o el punto de consigna es demasiado alto, la nanopipeta podría colisionar con la muestra, lo que provocaría artefactos de imagen o daños en el haz de pelo. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es pasar menos de 15 minutos por paquete de células ciliadas cuando se trabaja con células vivas. Después de obtener una imagen del paquete de cabello, uno podría intentar obtener grabaciones de un solo canal de ubicaciones específicas en la superficie de los estereocilios para responder preguntas sobre las propiedades del canal de mecanotransducción.
