Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01DA021194 y R01NS058850.

1. Cerebro rebanada preparación <ol><li> Jóvenes (15-40 días) hombres y mujeres ratas Sprague-Dawley se utilizan. (También utilizamos este mismo protocolo en ratones.) Bajo anestesia profunda de uretano, los animales se decapitan y el cerebro es rápidamente disecados. De 300 micras de grosor del cerebro que contiene la parte coronal midrostral de la sustancia negra se cortan en un vibratome Leica (VT-1200S). El corte de corte procedimiento se realiza en un helado, sacarosa oxigenada de corte de alta solución que contiene (en mM): 220 sacarosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 de NaHCO3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D- glucosa. Que se burbujea con una mezcla de 95% de CO O 2 / 2 al 5% para mantener oxigenada y mantener un pH de 7,4. Mantenga la solución de corte helada durante todo el procedimiento. </li><li> Los cortes de cerebro se incuban en una cámara de incubación lleno de un líquido cefalorraquídeo artificial oxigenada (ACSF) que contiene (en mM): NaCl 125, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 10 D-glucosa. Que se burbujea con una mezcla de 95% de CO O 2 / 2 al 5% para mantener oxigenada y mantener un pH de 7,4. La temperatura de incubación es de 34 ° C durante 45 minutos y luego a temperatura ambiente hasta que la rebanada del cerebro se transfiere a la cámara de grabación. </li></ol> 2. Toma de huellas dactilares electrofisiológicos de las neuronas nigral <ol><li> Una rebanada del cerebro se transfiere a una cámara de grabación de patch clamp continuamente perfundidos con la LCRa oxigenada a 32 ° C. </li><li> Pipetas de patch se extraen del autoclave borosilicato (KG-33) tubo capilar de vidrio (1,10 mm de diámetro, 1,65 mm de diámetro exterior, el rey de precisión de vidrio, Claremont, CA) usando un extractor de PC-10 (Narishige, Tokio, Japón) y se llena con solución intracelular preparado con DNasa libre de RNasa agua (Fisher Scientific) (que contiene 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl 2, pH ajustado a 7.3). Las pipetas de patch tienen resistencias de 3.2 mW en el baño. </li><li> La sustancia negra se identifica de acuerdo a su localización anatómica distinta (Fig. 1A1-2). Bajo la guía visual de un microscopio de vídeo (Olympus BX51W1), equipado con la óptica y la lente de 60X Nomarski inmersión en agua, las grandes células de la sustancia negra pars compacta (SNc) y la sustancia negra pars reticulata (SNR) (posible neuronas DA y las neuronas GABA) se seleccionan para la grabación. Convencionales giga-ohm sellado hermético de células enteras de configuración se obtiene (Fig. 1B1). Actual análisis de pinza de sujeción y la tensión se puede realizar. Para reducir al mínimo la degradación del ARNm, registro electrofisiológico debe ser breve (≤ 5 min). Una opción es único registro de la membrana y las propiedades de picos para facilitar las impresiones dactilares electrofisiológicos de las neuronas de los intereses (Fig. B2-3). Esta grabación breve demora sólo 1 min. </li></ol> 3. Citoplasma aspiración <ol><li> Después de las huellas dactilares electrofisiológicos y caracterización de SNr GABA y las neuronas DA, la succión suave en la boca para aspirar el citoplasma. El núcleo de la célula también se puede aspirar, resultando en la contaminación de ADN genómico. El sello hermético que no sea quebrantada, restos de lo contrario extracelular incluyendo ARNm puede ser succionado por la pipeta de parches y contaminar el contenido de la celda. La integridad del cierre hermético es bueno siempre y cuando el aumento de la corriente de mantenimiento a -70 mV no exceda de 100 pA. </li><li> A continuación, el contenido de la celda aspirado es expulsado en un tubo de PCR de 0,2 ml por romper la punta de la pipeta y una presión positiva pequeña. Contenido de una célula se recoge en un tubo de PCR. Después de aceptar el contenido de la celda, la recogida de tubos PCR, pre-enfriado en hielo, se coloca inmediatamente en un congelador a -20 ° C. </li><li> Para descartar la contaminación de los desechos extracelulares que pueden contener los ARNm, el parche pipeta se introduce en el tejido sin llegar a aspirar el citoplasma y el contenido de la pipeta es sometido a RT-PCR. </li></ol> 4. La transcripción inversa (RT) <ol><li> Después de recoger el contenido celular de un número razonable de las neuronas, por lo general 10-20, RT debe comenzar inmediatamente para reducir al mínimo la degradación del ARNm. </li><li> Dado que la cantidad de contenido de la celda de una sola neurona es demasiado pequeño, el procedimiento de aislamiento de ARN no se realiza. Para eliminar el potencial de contaminación de ADN genómico, el contenido de la celda es aspirado primero digerida por DNasa I (5 l de DNasa I y 1,6 l de DNasa I Buffer, 5 min a 25 ° C). Luego DNasa I se inactiva mediante la adición de 1,2 l de 25 mM EDTA y la incubación a 75 ° C durante 5 min. </li><li> ADNc se sintetiza con el superíndice III transcriptasa inversa basada en las células-Direct kit de síntesis de cDNA (Invitrogen, Tabla 1). Primera cadena de ADNc se sintetiza a 50 ° C durante 50 minutos, entonces la reacción es inactivada por incubación a 85 ° C durante 5 minutos y 1 l de RNasa H se agregaed de digerir ARNm (37 ° C durante 20 min). El cDNA de cadena simple se almacena a -20 ° C para la amplificación por PCR más tarde. </li><li> La eliminación completa de ADN genómico es verificada por RT-menos control en el que se omite la transcriptasa inversa, mientras que todos los componentes de la reacción otros eran exactamente iguales. </li></ol> 5. Dos etapas de amplificación de PCR <ol><li> Primers fueron diseñados de acuerdo a las secuencias en el GenBank. Siempre que sea posible, intrón-que abarca pares de cebadores fueron utilizados que ayudan a detectar la contaminación de ADN genómico. Primer secuencias par se enumeran en la Tabla 2. La eficacia de los pares de cebadores debe ser primero verificado por el ARNm de todo el cerebro que producen productos positivo. Todos los cebadores se sintetizan en Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, EE.UU.). </li><li> En la primera etapa, 5 l de los 30 l ADNc se amplifica por 35 ciclos de la presencia de la pareja de cebadores (Tabla 2). Los ciclos térmicos protocolo del termociclador (MasterCycler, Eppendorf, Tabla 1) es de 2 min a 94 ° C para la desnaturalización inicial, luego 35 ciclos de 15 s a 94 ° C para desnaturalizar, 30 s, a 55 ° C para recocer, y 45 s a 72 ° C para extender, seguido de 7 minutos para una última prórroga. Taq polimerasa de ADN, desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), y todos los demás componentes necesarios para la amplificación de PCR son proporcionados por una mezcla súper PCR (Invitrogen, Tabla 1) </li><li> En la segunda etapa de PCR, el producto de 1 l de la 1 ª etapa de amplificación de PCR se utilizó como molde y el primer par mismo que se utiliza en la primera etapa se utiliza (Tabla 2). 40 ciclos se ejecutan con el tiempo de extensión reducido a 30 s. La misma mezcla de PCR super se utiliza. </li><li> Los productos PCR de la amplificación de 2 ª etapa se separan por electroforesis en gel de agarosa al 2,5%, visualizado por bromuro de etidio (0,05 mg/100 ml de gel) o gelgreen bajo la luz ultravioleta y fotografiados (Fig. B4). Las bandas son positivos entonces cortada, extraído por medio de un kit de extracción de Qiagen (Tabla 1) y secuenciado, y en comparación con las secuencias publicadas de los genes diana. </li></ol> 6. Los resultados representativos: La dopamina (DA), las neuronas en la sustancia negra pars compacta y pars reticulata y la proyección de las neuronas vecinas GABA en la sustancia negra pars reticulata tienen distintas características electrofisiológicas (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Como se muestra en la figura. 1B2, SNr neuronas GABA muestran picos de frecuencia espontánea de alrededor de 10 Hz. Los picos tienen una duración base de alrededor de 1 ms. Tras la inyección de corriente hiperpolarizante, SNr neuronas GABA mostrar un hundimiento débil despolarización en respuesta a la hiperpolarización de inyección de corriente, lo que indica una débil expresión de la corriente I h en estas neuronas (Fig. 1B2). Por el contrario, la sustancia nigra neuronas DA presentan baja frecuencia (alrededor de 2 Hz) picos espontáneos que tienen una duración base de alrededor de 3 ms. Neuronas DA también muestran un hundimiento pronunciado en respuesta a la hiperpolarización de inyección de corriente, lo que indica una fuerte expresión de I h corriente (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011). SCRT-PCR detectó ARNm de la decarboxilasa del ácido glutámico 1 (GAD1, la enzima clave para la síntesis de GABA y un marcador para las neuronas GABA) en electrofisiológicamente identificado las neuronas GABA SNr, pero no en las neuronas DA (Fig. 1B4, 5). Por el contrario, SCRT-PCR detectó ARNm de la tirosina hidroxilasa (TH, enzima clave para la síntesis de dopamina y un marcador de neuronas DA) en electrofisiológicamente identificado SNC y las neuronas DA SNr, pero no en las neuronas GABA (Fig. 1B4, 5). Así SCRT-PCR resultados confirman la identificación de las neuronas electrofisiológicos. A continuación, SCRT-PCR se utilizó para el perfil de la expresión de la tensión activa KV3 subunidades canal Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4. Estas subunidades contribuyen a formar voltaje canales de K + de diversas propiedades en función de la composición de la subunidad (Ding et al. 2011). En el ejemplo SNr GABA neurona se muestra en la figura. 1B4, mRNAs de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron. En el ejemplo SNr DA neurona se muestra en la Fig.1B5, sólo Kv3.2 Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron. En los datos agrupados, Kv3.1 fue más frecuentemente detectados en SNr neuronas GABA que en nigral neuronas DA, lo que indica un mayor nivel de expresión de Kv3.1 en la rápida adición neuronas GABA SNr (Ding et al. 2011). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> Figura 1. Identificación electrofisiológica de las neuronas GABA SNr y las neuronas nigral DA A:.. Nigral áreas pueden ser identificadas por su localización anatómica distinta A1 muestra la ubicación del SNC y SNR en una corona manchada de Nissl sección capturado con un objetivo 1X. El área de caja se CAPTURed con un objetivo 10X y se muestra en el centro como indica la flecha. La SNC rico en células y células de los pobres SNr son claramente visibles. A2 muestra la ubicación de SNc y SNR en una sección en vivo, sin manchas coronal capturado con un objetivo de 4X. La SNC rico en células y células de los pobres SNr son claramente identificables. VTA, el área tegmental ventral. B1 muestra un parche de neuronas GABA SNr se sujeta en su conjunto de células modo. B2 se muestran las propiedades típicas electrofisiológicas de las neuronas GABA SNr en el modo actual de grabación de sujeción. Estas neuronas espontáneas de alta frecuencia potencial de acción de corta duración y tienen una débil que h respuesta mediada por el hundimiento de hiperpolarización de inyección de corriente. B3 muestra típica de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas DA nigral en el modo actual de grabación de sujeción. Se incendio espontáneo bajos potenciales de acción de frecuencia de larga duración y tienen un prominente I h mediada por el SAG (cabeza de flecha) respuesta a la hiperpolarización de inyección de corriente. Por lo tanto, SNr neuronas GABA y las neuronas de dopamina nigral están claramente identificados electrofisiológica. B4 muestra una imagen del gel de SCRT-PCR de un electrofisiológicos identificaron las neuronas GABA SNr. Glutamato decarboxilasa 1 (GAD1) ​​mRNA, pero no tirosina hidroxilasa (TH) mRNA se detectó. mRNAs de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron en este neuronas GABA SNr. B5 muestra SCRT-PCR la detección de ARNm canal neuronal KV3 en una neurona SNr DA. ARNm de TH, pero no ARNm GAD1 se detectó en un electrofisiológicamente identificado las neuronas DA SNr. mRNAs de Kv3.2, Kv3.3 y Kv3.4 se detectaron en este SNr DA neuronas. B6 muestra los datos agrupados. 7. Posibles resultados falsos negativos y falsos positivos Basándonos en nuestra experiencia, varios factores pueden dar lugar a falsos negativos SCRT-PCR resultados. Estos factores incluyen la falta de aspiración en cantidad suficiente del citoplasma, debido a la obstrucción de parches punta de la pipeta, la contaminación RNasa e ineficiente PCR. Parche obstrucción punta de la pipeta por lo general se puede ver en el monitor de vídeo y señalados por la resistencia a un mayor acceso. RNasa contaminación se puede evitar la desactivación completa y el uso de guantes. La eficacia de PCR de la imprimación debe ser probada mediante el uso de ARN total de tejido cerebral un golpe de puño (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011). Ya que siempre uso para el tratamiento de primera DNasa nuestras muestras antes de RT, no hemos encontrado resultados positivos falsos. En teoría, sin la digestión DNasa, contaminación de ADN genómico y por lo tanto la detección de falsos positivos pueden ocurrir cuando el gen se intronless o el primer par no abarca la región intrón.

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La combinación de la grabación de patch clamp en cortes de cerebro con SCRT-PCR hemos demostrado aquí proporcionan un excelente método para investigar los perfiles de expresión de mRNA de los canales iónicos, receptores y las enzimas clave para la síntesis de neurotransmisores en las neuronas caracteriza individualmente. Esto es particularmente útil cuando la proteína en cuestión no puede ser detectado y localizado por otros métodos como la inmunohistoquímica debido al bajo nivel de expresión y / o la falta...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. Reactivos y equipos clave <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabla 2" /> Tabla 2. Primer pares de rata neuronal KV3 canal, la tirosina hidroxilasa (TH) y el ácido glutámico decarboxilasa 1 (GAD1) ​​mRNAs para SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

En los mamíferos el sistema nervioso central, los diferentes tipos de neuronas con diversas características moleculares y funcionales se entremezclan entre sí difíciles otro, para separar y no se identifica fácilmente por su morfología. Por lo tanto, es a menudo difícil de analizar la expresión génica en un tipo de neurona específica. Aquí se documenta un procedimiento que combina células enteras patch clamp técnicas de grabación con una sola célula reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (SCRT-PCR) para el perfil de expresión de ARNm en los diferentes tipos de neuronas en el nigra sustancial. Técnicas electrofisiológicas se utilizó por primera vez para registrar las propiedades neurofisiológicas y funcional de las neuronas individuales. Entonces, el citoplasma de las neuronas individuales electrofisiológicamente caracteriza nigral se aspira y se somete a SCRT-PCR análisis para obtener los perfiles de expresión de ARNm de enzimas síntesis de neurotransmisores, receptores y canales iónicos. La alta selectividad y la sensibilidad que este método sea especialmente útil cuando la inmunohistoquímica no se pueden utilizar debido a la falta de anticuerpos adecuado o bajo nivel de expresión de la proteína. Este método también es aplicable a las neuronas de otras áreas del cerebro.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Las neuronas se caracterizan primera electrofisiológica. A continuación, el citoplasma de las neuronas registradas se aspira y se somete a la transcripción reversa-PCR y análisis para detectar la expresión de ARNm para enzimas síntesis de neurotransmisores, canales iónicos y receptores.

Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K vistas.  University of Tennessee College of Medicine. Las neuronas se caracterizan primera electrofisiológica. A continuación, el citoplasma de las neuronas registradas se aspira y se somete a la transcripción reversa-PCR y análisis para detectar la expresión de ARNm para enzimas síntesis de neurotransmisores, canales iónicos y receptores.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Investigación

Neurociencias

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...