1. La disociación de la célula <ol><li> Un diagrama de flujo delineando el protocolo que se muestra es la Figura 1. Para los números de catálogo de los reactivos particulares utilizados en este protocolo, por favor refiérase a la Tabla 1. Disección de la retina en un baño de PBS. Durante la disección, lo mejor es eliminar el vítreo y el cristalino ya que mantener con la retina puede impedir la disociación. No siempre es críticamente importante para eliminar todo el epitelio pigmentoso de la retina (EPR) y en algunos casos, puede ser imposible eliminarlo completamente. Sin embargo, para experimentos de células individuales de perfiles de fotorreceptores, del RPE deben ser eliminados. Si no se retira el EPR puede conducir a la contaminación de los perfiles de varilla de células del EPR con los genes expresados. Esto es presumiblemente debido a la conexión entre los fotorreceptores y RPE el. Para la disociación, enteros retinas murinos adultos se incuban a 37 ° C durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 20l papaína activado, 20 l 25 mM en cisteína 5 mM EDTA, y 360 l de Hank solución salina equilibrada (HBSS) suplementado con 10 mM de HEPES. Filtro de punta puntas de las pipetas se utilizan para todas las etapas de todo el protocolo para minimizar la contaminación potencial. La concentración de papaína y el tiempo de incubación puede variar según la edad y la naturaleza del tejido. Por ejemplo, para disociar el desarrollo de retinas aisladas en el día postnatal 0 (P0), incubar la retina en 10 l papaína activado, 10 l 25 Cisteína mM en EDTA 5 mM, y 380 l de Hank solución salina equilibrada (HBSS) suplementado con 10 mM de HEPES durante 10 minutos a 37 ° C. Retinas de diferentes especies requieren también unas condiciones ligeramente diferentes. Retinas de pollo son más delgadas que las retinas de ratones en la mayoría de las etapas de desarrollo. Utilizando 10 l papaína activado, 10 l 25 mM en cisteína 5 mM EDTA, y solución salina equilibrada de 380 l de Hank (HBSS) suplementado con HEPES 10 mM durante 5 min a 37 ° C es suficiente para disociar tstos retinas. </li><li> Golpear suavemente el tubo para desalojar las células establecidas, a continuación, se tritura suavemente 10-20 veces con una pipeta P1000. Incubar durante 10 min adicionales a 37 ° C si grumos grandes de tejido persistir y luego volver a triturar-10-20 veces. </li><li> Añadir 5 l de DNasa I (10 U / l) y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. Se tritura suavemente con una pipeta P1000. El número exacto de veces que tendrá que ser determinada empíricamente, pero generalmente está entre 10-20. </li><li> Centrifugar en una centrífuga de sobremesa a 3000 rpm durante 3 min Eliminar el sobrenadante, dejando 100-200 l de líquido en la parte inferior, y toca el tubo para desalojar el sedimento. Añadir 1 ml de HBSS y resuspender el precipitado con trituración suave. Al tocar el tubo es crítico aquí simplemente como resuspender el sedimento con muchos de lisar las células de la retina. Esto es especialmente cierto con adultos retinas murinas. </li><li> Se centrifuga a 3000 rpm durante 3 minutos con cuidado separar el sobrenadante y resuspender en 450 l de PBS que contienenIng. 0,1% de BSA. Es importante eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible para minimizar la presencia de ARNm de células lisadas y cualquier producto de la disociación que podría inhibir reacciones futuras. </li></ol> 2. Recolección de las células individuales <ol><li> Preparar dos platos 6 cm que contienen 5 ml de PBS suplementado con 0,1% de BSA. Placa las células disociadas en una sola placa y permiten que las células que conformarse con al menos 5 minutos. La densidad celular utilizada depende en gran medida de la naturaleza de las células individuales se perfiladas. Por ejemplo, para las células muy raras marcadas con un marcador fluorescente tal GFP, enteras retinas disociadas se colocan en un solo plato de 6 cm. Para las células que son algo más abundantes, menos células se sembraron inicialmente para hacer más fácil para cosechar una (o muy cerca de uno) de células con la micropipeta primero. </li><li> Colocar la placa de células disociadas en un microscopio invertido. Utilizamos el modelo de las IMT-2 de Olympus. Uso de pipetas que se han sometido a una fine punta (diámetro interno 0,5 mm, diámetro exterior 1,04 mm) (Figura 2) y, junto con un tubo aspirador, cosechar una sola célula. Las células entran fácilmente en la micropipeta cuando se coloca cerca de ellos en el plato. Es muy importante que el tubo de aspiración no es ni demasiado largo ni demasiado corto para que la distancia a la etapa asociada con el microscopio invertido (Los tubos aspiradores que utilizamos con nuestro microscopio invertido son 38,1 cm de largo). Si el tubo es demasiado largo, las células no pueden ser expulsados ​​de manera eficiente de la micropipeta en el tubo de recogida. La razón principal por la que utilizar el viejo modelo de las IMT-2 microscopio invertido es que hemos encontrado que tiene la distancia ideal para el escenario para nuestros tubos aspiradores de montaje. Después de entrar en la micropipeta, la célula (o células) es expulsado a una segunda placa (placa de lavado) para asegurar que una y solamente una célula se cosecha para perfiles de expresión génica. En la segunda placa a menudo es necesario para eliminar cualquiera de las células extrañas con una micropipeta nuevao mover la célula de interés en una ubicación diferente para asegurar que sólo una única célula entra en la micropipeta. </li><li> Cuando una célula individual está completamente aislado de las células vecinas, utilizar una micropipeta nueva para aspirar la célula de interés como en la sección 2.2 y luego expulsar directamente en un tubo de 0,2 ml de tampón de PCR que contiene 4,5 l de lisis celular. La célula es expulsado hacia el lado del tubo, teniendo cuidado de no romper la punta de la micropipeta en el tubo. Las muestras pueden ser hilados brevemente en una microcentrífuga de sobremesa para sumergir la celda en tampón de lisis. Este giro se hace generalmente después de cada célula quinta y luego de nuevo al final de collection.Tubes que contienen las células individuales en tampón de lisis se mantuvo en hielo durante la duración del aislamiento de células individuales. Para obtener resultados óptimos, las células individuales se recogen dentro de una ventana de dos horas después de la disociación. Después de este tiempo ha transcurrido, lo mejor es proceder a la etapa de transcripción reversa ya que el tiempo adicional ha sido observablesed para aumentar las posibilidades de la degradación del ARN. </li></ol> 3. Transcripción inversa <ol><li> En pocas palabras hacer girar las muestras en una mesa de trabajo minicentrifuge para asegurar que todas las células individuales están inmersos en el tampón de lisis celular. Para promover la lisis celular, incubar la muestra a 70 ° C durante 90 seg. en un termociclador. Inmediatamente colocar los tubos de nuevo en hielo. </li><li> Dejar los tubos en hielo durante 2 min. Para todas las adiciones de reactivos, usar el filtro de punta punta de la pipeta para evitar la contaminación. Para realizar la transcripción reversa, añadir 0,33 l III Superíndice (200 U / l), 0,05 l inhibidor de RNasa (40 U / l), y 0,07 l proteína T4 gen 32. Incubar la mezcla de reacción durante 50 min a 50 ° C en un termociclador. Inactivar la enzima a 70 ° C durante 15 minutos y el lugar en hielo. </li><li> Para quitar el cebador libre, añadir 0,1 Tampón Exonucleasa l (10X), 0,8 l dH 2 0 (grado biología molecular), y 0,1 l exonucleasa I (20 U / l). Incubar a 37 ° C durante 30 min enun termociclador. Inactivar la enzima mediante la incubación de la reacción a 80 ° C durante 25 min y luego colocando los tubos en hielo. </li></ol> 4. Tizón y Single Cell-PCR <ol><li> Añadir 6 l de la mezcla de reacción de asimetría y utilizar un termociclador de incubar la muestra a 37 ° C durante 20 min, 70 ° C durante 10 min, y mantener a 4 ° C </li><li> Añadir 10 l de la muestra de cola a la mezcla de reacción de PCR y realizar la síntesis de la segunda cadena y amplificación por PCR utilizando las siguientes condiciones: <ol><li> 95 ° C durante 2 min </li><li> 37 ° C durante 5 min </li><li> 72 ° C durante 16 min </li><li> 93 ° C durante 40 seg </li><li> 67 ° C durante 1 minuto </li><li> 72 ° C durante 6 minutos, añadiendo 6 segundos por ciclo </li><li> Vaya al paso 4 34 veces </li><li> 72 ° C durante 10 min </li><li> Mantener a 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Las etiquetas de los chips de Affymetrix <ol><li> Etiqueta 10-20 ug de ADNc (la concentración del resultado ADNc amplificadoción de una sola célula es generalmente ~ 1 g / l) para obtener una hibridación en microarrays de Affymetrix robusta. En primer lugar, el fragmento de ADNc mediante la adición de 10-20 l de la ADNc sola célula a 8 l 1X Uno-Phor-All tampón y 1 l de diluida (1:10 en 1X Uno-Phor-All tampón) DNaseI en un 80 l reacción. Incubar en un termociclador de 13 min a 37 ° C. Inactivar la DNasa I durante 15 minutos a 100 ° C y se pone en hielo. </li><li> Añadir 20 l tampón 5X TdT, 2,5 l de biotina N6-ddATP (Enzo Biosciences), y 1 l TdT (diluido 1:8 en tampón TdT). </li><li> Incubar durante 90 min a 37 ° C, y luego 5 min a 65 ° C. Almacenar a -20 ° C o hibridación de inmediato a un microarray de Affymetrix. La hibridación se lleva a cabo utilizando los protocolos estándar de Affymetrix. </li></ol> 6. Los resultados representativos Para evaluar la calidad de la l de ADNc, 10 de la muestra de ADNc se cargó en un 1% en gel de agarosa. El ADNc se juzga principalmente por el rango de tamaño (500-2000 pb)y la intensidad de la tinción de ADNc (Figura 1 y Figura 3a). En el gel se muestra en la Figura 1, cada otro carril muestra un frotis de ADNc a partir de células retinianas aislado E16.5. Los carriles de en medio de mostrar las manchas que resultan cuando los medios de comunicación sólo se aspira en la aguja y se deposita en el tubo de PCR. Estos carriles nunca son completamente desprovisto de un frotis débil, pero no muestran ningún resultado cuando genes específicos de cebadores de PCR se utilizan para amplificar los genes de ellos. Adicionalmente, la intensidad de la tinción de ADNc puede variar algo (compárese la Figura 1 y Figura 3a). En la Figura 3a carriles a, f, g, yh contienen sólidos frotis de ADNc mientras carriles b, c, d, ye son considerablemente menos robusta. Gen-PCR específica se utiliza como una pantalla secundaria de la calidad del ADNc de una sola célula. El ADNc de la Figura 3 se aislaron de fluorescentes las células ganglionares de la retina y que eran tested utilizando los cebadores de PCR para la retina las células ganglionares de marcadores Brn3b y Pax6. Para este ensayo, 1 l de la ADNc se sometió a PCR durante 30 ciclos. En tiempo real PCR cuantitativa sería preferible un ensayo, pero puede ser prohibitivamente caro y no es necesaria para evaluar la calidad simplemente ADNc. Todos los 8 de las células individuales dio positivo para Brn3b y 6 de cada 8 para Pax6 (Figura 3b). Incluso las manchas de cDNA que fueron menos robustos bandas producidas por Brn3b y Pax6. A pesar de estos resultados de la PCR, es nuestra experiencia que los frotis de ADNc como los de carriles b, c, d, ye no producen hibridaciones en matrices sólidas Affymetrix y se evitan generalmente. Gene PCR específica para el fotorreceptor Crx marcador se utilizó para determinar el nivel de contaminación en los ADNc de células individuales (Figura 3b). Un marcador fotorreceptor fue elegido debido a que estas células constituyen la mayoría de la retina (~ 70%) y, por lo tanto, cualquier lisis celular que se produjo muy probablemente implican varilla photoreceptors. Había sólo una cantidad débil de Crx presente en estas preparaciones de cDNA incluso después de 30 ciclos de PCR. Por último, esta pantalla basado en la PCR puede utilizarse para comenzar a determinar qué subconjuntos de un tipo de célula particular, los ADNc se obtuvieron a partir antes de someterlos a un perfil completo de microarrays. Esto puede ayudar a priorizar las células que están perfiladas, como este es el paso más caro en el proceso. Por ejemplo, hemos identificado subconjuntos de células ganglionares de la retina por cribado ellos por la presencia del gen Tachykinin1 (Figura 3b). Desde la pequeña pantalla basado en la PCR, en particular las células individuales se eligen y sus ADNc hibridado con un microarray de Affymetrix. Los datos de microarrays se compara y los patrones pueden ser descubiertos utilizando algoritmos estándar de agrupación. Heatmaps, tales como en la Figura 4, se generan para representar gráficamente los datos. Hay dos conclusiones principales en relación con los datos de las celdas individuales de perfiles en la figura4. En primer lugar, los genes expresados ​​en tipos celulares específicos se encuentran casi exclusivamente en aquellos tipos de células después de que el protocolo de única célula se lleva a cabo. En la mayoría de los casos en que los genes marcadores de un tipo de células se encuentran también en un segundo tipo celular, tales como la observación de que las células bipolares expresar algunos genes &quot;vara&quot; a niveles más bajos, esta expresión en el segundo tipo celular es fácilmente confirmado por ya sea in situ hibridación o tinción de anticuerpos. En segundo lugar, dentro de la más diversa amacrinas y los perfiles de las células ganglionares, la heterogeneidad de la expresión génica es inmediatamente evidente. Pou4f1 sólo se expresa en aproximadamente 1/4 de las células ganglionares en desarrollo, mientras que Nr4a2 y Scube2 son dos ejemplos de los genes expresados ​​en forma heterogénea diferentes células amacrinas. De hecho, los genes se muestran en la heatmap son sólo una pequeña muestra como varios cientos de genes han sido identificados y se confirmó como marcadores de células ganglionares en desarrollo o como marcadores de diferentes poblaciones de células amacrinas 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del método de celdas de un solo perfil. Retinas primeros son aislados y se disocia en las células individuales usando la papaína. En segundo lugar, las células individuales se cosechan con una aguja de cristal sacó y se deposita en tubos para PCR. Las células se lisaron y el ADNc amplificado utilizando la transcripción reversa seguida por PCR. La calidad de ADNc resultante se evalúa sobre un gel de agarosa tal como la que se muestra. Después de la escalera de ADN en el primer carril, los carriles de mostrar el frotis de cDNA a partir de células individuales (indicado por los corchetes rojos) que alternan con los productos de amplificación de los controles de los medios de comunicación. Los frotis de esta calidad (entre paréntesis rojos) se hibridó con microarrays de Affymetrix. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figura 2. Fotos de las agujas y el montaje del tubo aspirador. Células individuales se aíslan mediante la acción capilar de unsacó vidrio micropipeta (diámetro interno 0,5 mm, diámetro exterior 1,04 mm) y se transfieren por la presión de soplado en el aspirador. Es importante que el tubo aspirador es a la vez suficientemente largo para manipular fácilmente y lo suficientemente corto para descargar de forma fiable las células individuales. Una vista cercana del tubo capilar empujado a una aguja se muestra en B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figura 3. Ejemplo representativo de los frotis celulares individuales de cDNA y PCR de genes específicos. Para determinar la calidad de la célula después de la amplificación de cDNA, 10 l de cada muestra de células solo se ejecutaron en un gel de agarosa al 1% junto con un control negativo (A). Una prueba debería aparecer entre 500-2000 pb. Adicional basado en la PCR de detección de genes específicos puede ayudar a identificar y / o confirmar el tipo de célula que se aisló y la cantidad de contaminación presente en la muestra (B). Cebadores específicos para las células ganglionares retinianas marcadores Brn3by Pax6 se ensayaron para confirmar la identidad de estas células (filas 1 y 2). Para evaluar el grado de contaminación de los fotorreceptores en la preparación, primers específicos para el Crx fotorreceptor marcador se utiliza (fila 3). Subconjuntos de células ganglionares también pueden ser identificados a través de la detección de marcadores como Tachykinin1 (fila 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figura 4. Expresión de células única de genes marcadores. Los resultados de microarrays de genes seleccionados se expresan en 22 celdas individuales se puede apreciar en un formato de mapa de calor. Las intensidades de las señales de microarrays se han reducido para que corresponda con la intensidad del color rojo. Negro indica la ausencia de señal en el microarray. Las células ganglionares de la retina (RGC) precursores mostrados fueron aisladas de los puntos de tiempo embrionarias, mientras que las otras células se aislaron de las retinas de adultos.

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Un número cada vez mayor de los estudios están revelando robusta célula a célula de la variabilidad en las poblaciones que se creían ser más homogéneos en cuanto a su expresión de genes 6,8. En al menos un caso, esta expresión de los genes &quot;ruido&quot; se ha demostrado que desempeña una importante función biológica 13. Las diferencias de expresión génica entre las células individuales se oculta utilizando tejidos tradicionales de todo el método. Estos experimentos generar el pe...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

Poblaciones altamente especializados, pero muy pequeña de células juegan un papel importante en muchos tejidos. La identificación de células de tipo de marcadores específicos y programas de expresión génica para subconjuntos de células muy raras ha sido un reto con estándar de tejidos de todo el enfoque. Perfiles de expresión génica de las células individuales permite un acceso sin precedentes a los tipos de células que comprenden sólo un pequeño porcentaje del total del tejido 1-7. Además, esta técnica puede utilizarse para examinar los programas de expresión génica que se transitoriamente expresados ​​en un pequeño número de células durante las transiciones dinámicas de desarrollo 8. Este tema de la diversidad celular surge repetidamente en el sistema nervioso central (SNC), donde las conexiones neuronales puede ocurrir entre células muy diversos 9. El número exacto de distintos tipos de células que no se conoce con precisión, pero se ha estimado que puede haber hasta 1.000 tipos diferentes de la corteza itself 10. La función (s) de los complejos circuitos neuronales puede confiar en algunos de los tipos raros neuronales y los genes que expresan. Al identificar nuevos marcadores y ayudando a clasificar molecularmente diferentes neuronas, el enfoque de una sola célula es particularmente útil en el análisis de tipos de células en el sistema nervioso. También puede ayudar a dilucidar los mecanismos de desarrollo neuronal mediante la identificación de genes expresados ​​diferencialmente y vías genéticas durante las primeras etapas del desarrollo neuronal progenitora. Como un pañuelo de papel simple, de fácil acceso a la diversidad neuronal considerable, la retina de los vertebrados es un excelente sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo celular, la diferenciación neuronal y la diversificación de las neuronas. Sin embargo, como en otras partes del sistema nervioso central, esta diversidad celular puede presentar un problema para la determinación de las vías genéticas que conducen a la retina progenitores a adoptar un destino específico de célula, sobre todo teniendo en cuenta que fotorreceptores de los bastones conforman el mayoría de la población total de células de retina 11. Aquí se presenta un método para la identificación de las transcripciones expresadas en células de la retina individuales (Figura 1). La técnica del perfil de una sola célula permite la evaluación de la cantidad presente de la heterogeneidad dentro de las diferentes poblaciones celulares de la retina, 2,4,5,12. Además, este método ha revelado una gran cantidad de nuevos genes candidatos que pueden jugar un papel (s) en el destino de la célula de toma de decisiones que se producen en la población de células progenitoras de la retina 8. Con algunos ajustes sencillos para el protocolo, esta técnica puede ser utilizada para diferentes tejidos y tipos de células.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K vistas.  Iowa State University. Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Video: Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...