Nos gustaría agradecer al personal y los científicos en el OSE por su apoyo en el desarrollo y prueba de estos protocolos.

1. La transfección de células con plásmidos 293TN de embalaje y de Expresión de la Construcción <ol><li> Semillas 7,0 a 8,0 x 10 6 293TN células por placa de 15 cm de cultura 2 en 20 ml de medio de cultivo que contiene medio DMEM suplementado con 4 mM de L-glutamina, 4,5 g de glucosa / l, y suero bovino fetal (10%) sin antibióticos. Crecer durante 18-24 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 de manera que la densidad celular alcanza 60-80% de confluencia en el momento de la transfección. En algunos casos, puede ser necesario para las placas de semillas de varias células para obtener un alto título suficiente para la transducción de las células diana. </li><li> Para cada placa de las células, añadir 1,6 ml de DMEM libre de suero a un autoclave tubo 2 ml Eppendorff. Añadir 45 l pPACKH1 o pPACKF1 y 4,5 g de la construcción de lentivirus de la DMEM y mezcla pipeteando arriba y hacia abajo. </li><li> Añadir 55 l de PureFection en el mismo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a temperatura ambiente fo 15 min. </li><li> Agregue el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a la placa de cultivo de tejidos, gota a gota y agitar suavemente para dispersar uniformemente en toda la placa. Vuelva a colocar el plato a la incubadora y crecer a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> No hay necesidad de cambiar los medios de comunicación después de la transfección. Si su lentivirus construcción expresa un gen que codifica una proteína fluorescente GFP, como, revisar sus células bajo el microscopio de 12-24 horas después de la transfección. Debería ser capaz de ver las células&gt; 90% GFP-positivo, lo que indica que la transfección se realizó correctamente. </li><li> Recoger el sobrenadante del cultivo de células después de 48 y 72 horas en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante del cultivo celular ahora contiene partículas infecciosas pseudoviral. (Siga las pautas recomendadas para trabajar con la clase de seguridad BSL-2.) Se centrifuga a 1.500 xg durante 15 min a temperatura ambiente para precipitar los restos celulares. Transferir el sobrenadante viral a un nuevo tubo, asegurando de no perturbar el sedimento. </li><li> Células 293TN que han sido utilizados para el envasado viral debe ser eliminado de un contenedor séptico y no han de ser utilizados para rondas adicionales de embalaje viral. </li></ol> 2. La concentración del sobrenadante viral <ol><li> Añadir 1 volumen de frío (4 ° C) de PEG-lo solución de precipitación virus a cada 4 volúmenes de lentiviral partícula que contiene sobrenadante. La precipitación de partículas lentiviral de grandes volúmenes se puede lograr con Corning 250 tubos de centrífuga de polipropileno ml. Mezclar la solución por los tiempos de inversión de los tubos varias, pero no del vórtice de la mezcla. </li><li> Refrigerar la solución a 4 ° C durante al menos 12 horas (hasta 4 días es aceptable). No agitar o rotar los tubos durante la etapa de refrigeración. </li><li> Centrifugar el sobrenadante / PEG-se mezcla a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación, las partículas lentiviral aparecerá como un precipitado de color beige o blanco en la parte inferior del tubo. Vierta el supernatant. </li><li> Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo cuidado de no alterar las partículas precipitadas lentivirales en el sedimento. Trazas de PEG-residual se va a diluir el virus (reduciendo así el título), pero no afecta a la integridad de las células diana desde el PEG-que es inerte y no tóxico. </li><li> Resuspender y combinar las partículas lentiviral en 1/100 del volumen original utilizando frío (4 ° C), fosfato estéril o solución salina tamponada con DMEM que contenía 25 mM de tampón HEPES. </li><li> Dividir en partes alícuotas en viales criogénicos estériles y se almacena a -70 ° C hasta que estén listos para su uso. </li></ol> 3. Titulación viral y transducción de las células diana <ol><li> Le recomendamos titulación de las partículas antes de la transducción de lentivirus el objetivo de las células de interés y el cálculo de la multiplicidad caso de infección (MOI) de las células diana para la coherencia entre los experimentos. Tituló el virus, se recomienda utilizar las células HT1080 como una línea de control fácil de infectar a positivo. Pl.facilidad en cuenta que el protocolo titering implica transducir células HT1080 con una pequeña alícuota de las partículas lentiviral que han envasados. Una vez que el título se sabe, las células diana de interés también puede ser transducidas con las partículas producidas lentivirales. Un protocolo de Titulación recomendamos se puede encontrar en: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Placas 50.000 células diana de interés por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de cultivo celular. Utilice los medios de comunicación que las células normalmente se cultivan in crecer las células durante la noche en sus condiciones de cultivo específicas. Las células deben ser entre 50 a 70% confluentes en el día de la transducción. </li><li> En el día de la transducción, aspirar los medios de comunicación de las células. Combinar medio de cultivo con TransDux a una concentración de 1 x final (por ejemplo, 2,5 l TransDux a 500 l de medio de cultivo). A continuación, traslado de la TransDux-ceEl cultivo LL mezcla medio a cada pocillo. </li><li> Pipetear el volumen apropiado de virus que corresponde a la óptima MOI para las células diana en cada pocillo. Si la MOI óptimo es desconocido, se recomienda tratar una gama de diferentes MOI (tal como una MOI de 1, 2 y 5 para fácil de infectar las células de cultivo de tejidos, y una MOI de 1, 10 y 20 para más difíciles de a infectar a las células primarias). Si la concentración de las partículas lentiviral no es conocido (como se determina a través de un protocolo titering virus), diferentes volúmenes de virus puede ser tratado, tal como l 1, 2 y 5 del virus. El virus puede permanecer en contacto con las células diana por hasta 72 horas. </li><li> Otros experimentos con las células transducidas de interés objetivo puede ser iniciada 72 horas después de la transducción, una vez que el constructo viral ha integrado en el genoma de la célula huésped. Cambiar el medio y el paso de la meta de las células de interés de acuerdo a sus necesidades específicas. </li></ol> 4. Los resultados representativos <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; La transfección de células 293TN La densidad inicial de las células 293TN es crítico para el envasado viral exitosa. Células 293TN debe estar entre 60 -80% confluente el día de la transfección (Figura 2). Si las células 293TN son menos del 60% confluentes, que puedan crecer durante unas horas más antes de intentar la transfección. Si las células son confluentes 293TN&gt; 80%, deben ser replated antes de la transfección. Si se utiliza un GFP lentivirus expresar, por lo menos 90% de las células 293TN debe fluorescencia verde 24 horas después de la transfección, lo que indica una transfección exitosa (Figura 3). Si menos del 90% de las células son GFP-positivo, no proceda con el siguiente paso, porque esto indica que la transfección no tuvo éxito, y los títulos virales será baja. En cambio, la placa 293TN nuevas células y empezar de nuevo, asegurándose de que las células son 293TN a la densidad celular adecuada antes de la transfección. 293TN células pueden quitar las placas de cultivo de tejidos de 48-72 horas después de la transfección. Esto no afecta negativamente a la producción de partículas lentivirales. Titulando con células HT1080 Los títulos virales se puede calcular utilizando el kit de OSE global Titulación ultrarrápido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir la integración de la secuencia viral WPRE a partir del vector lentiviral en las células HT1080 y la compara con una curva estándar, basada en una secuencia de referencia genómico para medir con precisión las unidades infecciosas por ml (Figura 4). La transducción de las células diana Si se utiliza partículas lentivirales que expresan un marcador GFP constitutivamente activa, las células GFP positivos deberían comenzar a aparecer dentro de 12-24 horas de la transducción, si la reacción de transducción está trabajando. La expresión de GFP debe continuar después de la construcción se integra en forma estable lentiviral tél alojar genoma de la célula. Si con la transducción de las MOI diferentes, la fluorescencia de GFP aproximadamente debe coincidir con el momento de inercia, donde las MOI bajas muestran una menor fluorescencia de la GFP y el aumento de las MOI muestran un aumento de la fluorescencia de GFP (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visión general del protocolo de la producción viral. Los plásmidos de envasado y lentivirus PPACK se mezclan y se co-transfectaron en células 293TN. Después de 48 -72 horas, el sobrenadante viral se recoge, y las partículas virales se precipitó con PEG-ella. Después de titulación de las partículas lentivirales, que puede ser utilizado para la transducción de la meta de las células de interés. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fase de contraste de imagen de las células 293TN. Celular Density debe ser de entre 60-80% confluente el día de la transfección. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La imagen fluorescente de las células GFP-positivas 293TN 24 horas después de la transfección con Purefection, pPACKH1, y un lentivirus GFP construir codificación. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Resultados WPRE qPCR y la curva estándar obtenida usando el kit de Global OSE Titulación ultrarrápido para el cálculo de MOI y el título correspondiente de paquetes de partículas virales. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Imágenes de la Figura 5. Fluorescentes de las células HT1080 transducidas con cantidades crecientes de los lentivirus. Las imágenes son de 72 horas después de la transducción.

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	<li>Cann, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).</li><li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li><li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li><li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool.">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li></ol>

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Este embalaje viral y la transducción de las células objetivo del Protocolo ha sido optimizado para su uso con los reactivos de empaque virales de SBI. La sustitución de otros reactivos pueden afectar el resultado del protocolo. Este protocolo sólo se ha optimizado para la producción lentiviral y puede no ser adecuado para producir otros tipos de virus o pseudoviruses. Envases viral exitosa depende de varios pasos clave. Las células 293TN expresan el antígeno T de SV40 grande, que es absolutamente necesario para la secreción de las partículas lentiviral en el sobrenadante del cultivo celular. La densidad en el que las células son 293TN en el momento de la transfección es especialmente importante para que el reactivo PureFection para transferir suficientemente el lentivirus y plásmidos de envasado en las células. Adición de la mezcla PureFection a la placa de cultivo de tejidos de una manera gota a gota seguido por agitación a fondo la placa es importante para la dispersión de los plásmidos de envasadoy lentivirus construir a lo largo de todas las células. El fracaso para distribuir apropiadamente los vectores puede resultar insuficiente partículas lentiviral que se producen. La reacción de envases viral puede ser ampliado para la producción de virus de alto título, basado en el área de la superficie de las placas de cultivo de tejidos. Uno puede elegir a la placa de varios platos de cultivo de tejidos de células 293TN por constructo que necesita ser embalado. La concentración de los sobrenadantes virales es especialmente útil en la creación de alto título de virus. Sobrenadante viral a partir de placas múltiples de células pueden ser combinadas y se concentraron para su uso en experimentos in vivo, o para las células que son difíciles de transducir. Titulación de las partículas producidas lentiviral es importante para el cálculo de una precisa MOI a utilizar para la transducción de las células diana. Conociendo el momento de inercia que se utilizó en una transducción dado permite reparación en el caso de que la transducción no es correcta. Por ejemplo, utilizando una MOI que esdemasiado baja puede dar lugar a células diana que expresan muy pocos el constructo de interés. El uso de un momento de inercia que es demasiado alto, sin embargo, puede dar lugar a células diana que muestran signos de estrés. El objetivo es usar una MOI que maximiza la expresión del constructo de interés, preservando la salud de las células. Aunque se recomienda un protocolo titering qPCR basado en que mide copias integradas del constructo lentiviral en las células HT1080, otros enfoques tituló también se puede utilizar, tales como ELISA p24 o estimación del porcentaje de células positivas GFP. El éxito de la transducción de las células diana es también dependiente de varios factores clave. TransDux es un reactivo de infección único que permite una alta eficiencia de transducción, pero que no es tóxico para las células. TransDux puede utilizarse en lugar de polibreno, que a menudo es tóxico para las células diana. La inclusión de TransDux en la transducción de las células diana ayuda para neutralizar las cargas sobre las partículas virales y permite que el virus en la células. Desde TransDux no es tóxico para las células, se puede permitir que las partículas lentiviral a permanecer en contacto con las células durante 72 horas (el tiempo en que los constructos virales han integrado en el genoma de la célula huésped), aumentando así la probabilidad de que el partículas virales de entrar en la célula. Para algunas células difíciles de transduce, transducción se puede repetir en días sucesivos para aumentar la eficiencia de transducción. Por ejemplo, transducir las células en el día 1, permitir que las células para descansar en el día 2 y, a continuación transducir las células de nuevo el día 3. Es importante que esperar 72 horas después de la transducción última antes de la selección principio, experimentos adicionales o caracterización de las células diana. Embalaje viral eficiente es también depende del tamaño del constructo lentiviral, entre el 5 &#39;y regiones 3&#39;LTR. Esta sección de la construcción lentiviral debe ser de aproximadamente 9 kb o menos, lo que corresponde al tamaño del genoma del VIH nativo. Superior al 9 kb de mayo deaumentar el título de las partículas producidas pseudoviral. La nueva tecnología, como piggyBac vectores de transposones, permitir la integración fiable y estable de los transgenes de hasta 100 kb a través de una sola transfección. Este enfoque puede ser utilizado para las construcciones que exceden el límite de tamaño para los vectores lentiviral, en los casos en que es posible transfectar células diana, y proporciona la ventaja adicional de no requerir una etapa de envasado viral 9,10. Las partículas producidas pseudoviral que utilizan este protocolo son infecciosos en que pueden infectar a la mayoría de tipos de células de mamíferos. Los productos utilizados en este protocolo, sin embargo, son de tercera generación BIOSAFE ya que producen no replicativa y pseudoviruses auto-inactivantes. Por lo tanto, una vez traducida en las células diana o los animales, las células diana o animales no son infecciosas o contagiosas. La sustitución de otros lentivirus plásmidos que no son de tercera generación BIOSAFE es posible aunque no es recomendable a partir de una seguridad de la biotecnologíaperspectiva. El protocolo de la producción viral y la transducción de las células diana siguiente debería llevarse a cabo bajo nivel de bioseguridad 2, de acuerdo con las directrices del NIH 11, y los investigadores siempre deben usar una bata de laboratorio y guantes para manipular las partículas virales. Las pilas de productores 293TN, tubos de partículas virales, y pipetas desechables se deben tirar en un contenedor de riesgo biológico correspondiente. Pipetas reutilizables y material de vidrio deben ser descontaminados con cloro y autoclave para disminuir la exposición del personal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM medio de glucosa de alta </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> Las células 293TN </td><td> OSE </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> OSE </td><td> LV500A-1 </td><td> Para el VIH basados ​​en lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> OSE </td><td> LV100A-1 </td><td> Para FIV basados ​​en lentivectors </td></tr><tr><td> Cualquier vector lentiviral </td><td> OSE </td><td> Varios </td><td> cDNA, shRNA, microRNA, los reporteros de la transcripción </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> OSE </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-lo </td><td> OSE </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Global Titulación ultrarrápido </td><td> OSE </td><td> LV961A-1 </td><td> No se han descrito en este protocolo, pero es necesario para titular las partículas virales </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> OSE </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

Como con el estándar de vectores plasmídicos, es posible transfectar lentivectors en forma de plásmido en las células con bajo a mediano eficiencia para obtener la expresión transitoria de efectores. Constructos de embalaje lentiviral expresión en partículas pseudoviral, sin embargo, permite hasta 100% de transducción, incluso con difíciles de transfectar células, tales como tallo principal, y las células diferenciadas. Además, la entrega lentiviral no produce las respuestas celulares específicos asociados típicamente con transfecciones químicos, tales como la muerte celular resultante de la toxicidad del reactivo de transfección 1, 2. Cuando transducidas en las células diana, el constructo lentiviral integra en el ADN genómico y proporciona la expresión estable de la horquilla pequeño ARN (shRNA), gen microARN ADNc, o reportero 3, 4. Las células diana que expresan establemente la molécula efectora se puede aislar utilizando un marcador seleccionable contenida en el vector de expresión construir tales como puromicina o GFP. Después de pspartículas eudoviral infectar las células diana, no puede replicarse dentro de las células diana debido a que los genes estructurales víricas están ausentes y las repeticiones terminales largas (LTR) están diseñados para ser auto-inactivación en la transducción de 5, 6. Hay tres componentes principales necesarios para el envasado eficiente lentiviral 1, 5, 6, 7. <ol><li> El vector de expresión lentiviral que contiene algunos de los elementos genéticos requeridos para el envasado, la integración estable de la expresión viral construir en el ADN genómico, y la expresión del efector o informador. </li><li> Los plásmidos de envasado lentiviral que proporcionan las proteínas esenciales para la transcripción y el envasado de una copia de ARN de la construcción de expresión recombinantes en partículas pseudoviral. Este protocolo utiliza los plásmidos PPACK (OSE) que codifican para gag, pol, y revoluciones del genoma del VIH o la FIV y la proteína virus de la estomatitis vesicular g (VSV-G) para la proteína de la cápsida viral. </li><li> 293TN producen<html> r células (derivado de células HEK293) que expresan el antígeno T de SV40 grande, lo cual es necesario para la producción de alto título lentiviral y un gen de resistencia a neomicina, útil para volver a seleccionar las células para su mantenimiento. </li></ol> Una visión general del protocolo de producción viral puede verse en la Figura 1. Producción viral se inicia por la co-transfección de células productoras 293TN con el vector de expresión lentiviral y los plásmidos de embalaje. Las partículas virales son secretadas en los medios de comunicación. Después de 48-72 horas, los medios de cultivo celular se cosecha. Los restos celulares se retira de los medios de cultivo celular, y las partículas virales se precipitó por centrifugación con PEG-que para la concentración. Producido partículas lentiviral luego se titularon y se puede utilizar para transducir células diana. Los detalles de Titulación viral no están incluidos en este protocolo, pero se puede encontrar en: anco &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Este protocolo ha sido optimizado con los productos específicos que se indican. Otros reactivos puede ser sustituido, pero el mismo resultado no puede ser garantizada.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral vectores de expresión son los medios más eficaces para que expresan establemente diferentes moléculas efectoras o reportero construcciones para dividir y no dividir las células de mamíferos y organismos enteros. A continuación presentamos un protocolo sobre cómo empaquetar construcciones lentivirus de expresión en las partículas pseudoviral y la transducción de las células diana utilizando las partículas pseudoviral.

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K vistas.  System Biosciences. Lentiviral vectores de expresión son los medios más eficaces para que expresan establemente diferentes moléculas efectoras o reportero construcciones para dividir y no dividir las células de mamíferos y organismos enteros. A continuación presentamos un protocolo sobre cómo empaquetar construcciones lentivirus de expresión en las partículas pseudoviral y la transducción de las células diana utilizando las partículas pseudoviral.

Video: Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Producción de partículas Pseudotyped estudiar coronavirus altamente patógena en un ambiente de nivel 2 de bioseguridad

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Evaluación de la neutralización sérica contra el SARS-CoV-2 con virus pseudotipados

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Autor destacado: Estudio de las interacciones huésped-virus con virus pseudotipados 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

Embalaje VIH o FIV basados en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped