Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer.

1. Preparación de cepas madres <ol><li> Hacer reservas de maestros de los compuestos a ensayar en DMSO. Preparar las poblaciones a una concentración estándar de 20 mm. Nota: cualquier concentración superior a 10 mM se puede utilizar. Los compuestos que pueden utilizarse como controles positivos para validar este ensayo incluyen RAL, EVG, y DTG. </li><li> Asegurar los compuestos se disolvieron en DMSO por agitación las soluciones múltiples veces durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Guarde las soluciones madre 20 mM en la oscuridad a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 2. Preparación de las placas de 96 pocillos durante la investigación de compuestos <ol><li> Elija la línea de células para ser probado (por ejemplo, HOS o TZM-bl) y sembrar 100 l de esas células a una densidad de 4 x 10 4 células / ml (4.000 células / pocillo) en medios de comunicación (por ejemplo, modificado Eagle o DMEM medio Dulbecco suplementado con 5% (v / v) de suero fetal bovino, 5% de suero de ternero recién nacido, y penicilina (50 unidades / ml) más estreptomycin). </li></ol> 3. Generación de Virus Stocks Producir VSV-G-pseudotyped VIH mediante la transfección de células 293 (como se muestra en la Figura 1, paso 1) 32-34. <ol><li> El día antes de la transfección, placa 293 células en placas de 100 mm de diámetro a una densidad de 1,5 x 10 6 células. </li><li> En el día de la transfección, transfectar las células 293 con 16 g de tipo salvaje o mutante del VIH (pNLNgoMIVR - ΔLUC) y 4 g de VEV (pHCMV-g) usando el método de fosfato de calcio 35. </li><li> Aproximadamente 6 horas después de la precipitado de fosfato de calcio se añade, lavar las células 293 dos veces con tampón fosfato salino (PBS) y se incuban con medio fresco durante 48 horas. [DMEM suplementado con 5% (v / v) de suero fetal bovino, 5% de suero de ternero recién nacido, y penicilina (50 unidades / ml) más estreptomicina (50 mg / ml)]. </li><li> Se recoge el virus que contiene sobrenadantes mediante la eliminación de los medios de comunicación desde el diámetro 100 mmplatos, aclarar los sobrenadantes por centrifugación a baja velocidad a 3.000 rpm durante 10 min, filtrar los sobrenadantes a través de un filtro de 45 micras de tamaño de poro de la jeringa, el tratamiento de los sobrenadantes con Turbo DNasa durante 30 min a TA y se diluye en los sobrenadantes de los medios de comunicación para la preparación en ensayos de infección . Almacene los sobrenadantes virales congelados, en alícuotas, a -80 ° C. Nota: la cantidad de p24 en el sobrenadante se determina mediante el uso de un kit de ensayo de inmunoabsorción p24 de VIH-1 ligado a enzimas. La concentración de p24 se utiliza para controlar la cantidad de virus en la muestra. Aproximadamente 500 ng de virus se añadió a las células HOS sembradas en placas sobre platos de 60 mm de diámetro a una densidad de 1,5 x 10 5 células / placa en el día antes de la infección. Después de un 48 horas de incubación, las células se cosecharon, recogieron por centrifugación, se lavaron, y se resuspendieron en 100 l de PBS. Añadir una cantidad igual de reportero luminiscencia reactivo de ensayo de genes y medir la actividad luciferasa como se describe en las secciones 5.4.1 y5.4.2. A partir de este, una dilución apropiada de virus se puede hacer como se describe en el paso 4.6. </li></ol> 4. Compuesto Proyección en placas de 96 pocillos Screen cada compuesto por triplicado y promediar los resultados. Nota: el efecto de cada compuesto sobre la replicación viral se corrige mediante la normalización al nivel de la replicación obtenida en ausencia de cualquier compuesto. <ol><li> Determinar el rango de concentración empírica que se proyectarán. Nota: por lo general, las pantallas con 11 diluciones seriadas se realizan añadiendo el compuesto de la columna de platos por columna y pantallas con 7 diluciones seriadas se hacen añadiendo el compuesto por fila. Uno triplicado conjunto de pozos debe ser reservado para el control sin compuesto. Además, una columna o una fila deben permanecer en blanco para actuar como control negativo / fondo. Por último, si se trata de una citotoxicidad celular o ensayo de infectividad dictará si se añade el virus. </li><li> Preparardiluciones en serie a partir de la solución madre 20 mM. Las concentraciones se eligen en función de la gama de concentraciones determinado empíricamente para ser sometidas a ensayo (como se muestra en la Tabla 1). Preparar las diluciones en medios de comunicación en 10 veces la concentración final deseada, es decir, si la concentración final va a ser 100 M, hacer una reserva de trabajo 1 mM. Nota: Los compuestos con IC 50 s por encima de 5-10 M no suelen ser buenos candidatos para el desarrollo de fármacos. En los ensayos iniciales ponemos a prueba los compuestos sólo contra el vector PESO. Compuestos prometedores que inhiben eficazmente el vector PESO entonces se miden frente a un panel de mutantes resistentes a los medicamentos. </li><li> Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora y añadir las diluciones en serie de los compuestos a ensayar a los pocillos en triplicado (como se muestra en la Figura 1, paso 2). Nota: el volumen añadido al pozo debe ser 1/10 de volumen de la concentración final. Por lo tanto, añadir 22 l / pocillo (volumen final pAdemás virus ost es de 220 l) para los ensayos de infectividad. Para los ensayos de citotoxicidad, añadir 11 l / pocillo (volumen final es de 110 l / pocillo). </li><li> Devolver las placas de 96 pocillos a la incubadora. Para una pantalla de citotoxicidad celular, incubar las placas de 96 pocillos 48 horas a 37 ° C y no se necesitan más manipulaciones en el Protocolo 4: continuar con el Protocolo 5 Para los ensayos de infectividad, continúe siguiendo las instrucciones que figuran en el Protocolo 4.. </li><li> Ensayos de infectividad solamente. Retirar las placas de la incubadora después de un mínimo de 3 horas de incubación a 37 ° C con los compuestos a ser analizados. Nota: esto permite que el compuesto para ser absorbido por las células antes de la infección con el vector de VIH. </li><li> Preparar una dilución de stock del virus 33, 34 (por lo general aproximadamente 01:03) que producirá una señal de luciferasa entre 0,2-1,5 unidades relativas de luciferasa (RLU) en células no tratadas. Una placa entera tomará aproximadamente 10 ml de diluciónvirus ted. Añadir 100 l de virus a cada uno de los pozos, utilizando ya sea un 8 o 12 Pipeta multicanal. No agregue virus a los pocillos de control negativo / fondo. Vuelva a poner las placas a la 37 ° C incubadora durante 48 horas. Nota: una acción de dilución del virus 1:03 dilución es típico que producirá una señal de luciferasa entre 0,2 -1,5 RLU basado en un ensayo de p24 demostrando que la concentración viral en el sobrenadante es de aproximadamente 500 ng en 1,0 ml. </li></ol> 5. Preparación y evaluación de la citotoxicidad y la infectividad en placas de 96 pocillos <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de los pozos (rojo fenol en los medios de comunicación puede interferir con la señal de luciferasa). Usar una pipeta de vidrio con una punta de pipeta 200 l unida al extremo. Comience en la parte superior de los medios de comunicación y trabajar poco a poco hacia abajo, hacia la parte inferior del pozo. No gaste demasiado tiempo en el fondo del pozo, o las células pueden ser removidos del pozo. </li><li> Añadir 100 l de PBS suplementado con 0,5 mM de MgCl 2 a cada pocillo. Esto tiene que ser hecho inmediatamente después de que se retiró el medio de manera que las células no se sequen. </li><li> Sólo para los ensayos de citotoxicidad, añadir 5 ml de tampón de sustrato a partir del ensayo de detección de luminiscencia de ATP a cada vial de reactivo liofilizado suministrado. Un vial es suficiente para una placa de 96 pocillos. <ol><li> Añadir 50 l de tampón de lisis celular del ensayo de detección de luminiscencia de ATP a cada pocillo. Agitar la placa de 96 pocillos a 700 rpm a temperatura ambiente durante 5 min utilizando un termomezclador compacto. </li><li> Añadir 50 l de reactivo de ensayo de detección de luminiscencia ATP reconstituido a cada pocillo con excepción de los pozos de control / fondo negativos. Agitar a 700 rpm a temperatura ambiente durante 5 min utilizando un termomezclador compacto. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir tiempo para el desarrollo de la señal. </li><li> Lea la placa de 96 pocillos usando el luminómetro de microplacas. Nota: abrir el programa luminómetro de microplacas SoftMax Pro. Asegúrese de que el luminómetro está configurado para medir luminescence con una sensibilidad de 5 lecturas / pocillo. </li></ol></li><li> Sólo para los ensayos de infectividad, añadir 10 ml de tampón de sustrato a partir del ensayo de gen informador de luminiscencia a cada vial de reactivo liofilizado suministrado. Un vial es suficiente para cada placa de 96 pocillos. <ol><li> Añadir 100 l de reactivo de ensayo reconstituida reportero gen de luminiscencia para cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir tiempo para el desarrollo de la señal. </li><li> Lea la placa de 96 pocillos usando un luminómetro de microplaca como se realizó en la sección 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Determinación de la CC 50 e IC 50 valores para los Compuestos <ol><li> La transferencia de los datos de la luciferasa del luminómetro de microplacas en una hoja de cálculo Excel. <ol><li> Promedio tanto los datos de la luciferasa, por triplicado, y los datos de la señal de fondo / de control. Restar la señal de fondo media / de control de la señal media por triplicado para todo el intervalo de concentración. </li> &lt;Li&gt; normalizar la corrección de fondo a la señal promedio de los intervalos de concentración en contra de la actividad, si se trata de la citotoxicidad o la infectividad, en ausencia de cualquier compuesto para determinar el porcentaje de inhibición. Nota: el porcentaje de inhibición se define como la actividad de la luciferasa en presencia de fármaco dividido por la actividad de la luciferasa en ausencia de fármaco multiplicado por 100. </li></ol></li><li> Utilice el programa de software para obtener Kaleidagraf CC 50 e IC 50 valores <ol><li> Traslado tanto el intervalo de concentraciones determinado empíricamente y la inhibición de la actividad de la luciferasa por ciento en Kaleidagraf. </li><li> Representar gráficamente los datos con el rango de concentración en el eje x y la inhibición de la actividad de la luciferasa por ciento en el eje y. </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un ensayo rápido, eficiente y reproducible que se puede utilizar para seleccionar compuestos para la citotoxicidad y por su capacidad para inhibir la replicación de ambos WT y resistente VIH-1 de drogas. La capacidad de identificar rápidamente compuestos y probar su eficacia y la citotoxicidad es crucial en el desarrollo de nuevos y mejores medicamentos contra el VIH-1. Una vez que se identifican los compuestos de plomo, análogos del compuesto de plomo pueden ser producidos y probados utilizando el mismo ensayo. El ensayo es relativamente simple. Hay dos controles positivos y negativos que permiten al usuario a diagnosticar los problemas más comunes (compuestos tóxicos, problemas con el vector stock). El uso de un conjunto por triplicado de pocillos sin compuesto añadido muestra que se ha producido la infección viral. El hecho de que la citotoxicidad se mide en un ensayo independiente Evita mala interpretación de una reducción de la luciferasa causada por la citotoxicidad como un efecto específico sobre la replicación viral. Los pasos críticosen el protocolo se preparan las placas de manera que las células se distribuyen uniformemente en los pocillos, los pocillos que tienen las concentraciones apropiadas de los compuestos a ensayar, la adición de la misma cantidad de virus a cada uno de los pocillos, y midiendo la actividad de luciferasa a determinar la CC 50 e IC 50 valores. El ensayo es seguro, cuantitativa y reproducible. El ensayo es seguro porque el vector es de replicación defectuosa. El ensayo es cuantitativa y reproducible, ya que se basa en un único vector redondo que expresa luciferasa, que puede ser ensayada con precisión y convenientemente. En un ensayo de replicación del virus ronda múltiples, el CI medido 50 depende del número de ciclos de vida virales; este es un problema particular cuando los ensayos implican ambos WT y los virus resistentes a los fármacos que pueden tener capacidades significativamente diferentes de replicación. Se han realizado varios ensayos enzimáticos informado anteriormente de que puedaser utilizado para la detección de inhibidores de la IN. Los ensayos que implican la tecnología de PCR en tiempo real para medir ADN integrado requieren proteínas recombinantes purificadas (s), y son, en general, tanto más mano de obra intensiva y costosa 36, 37. Aunque es posible utilizar ensayos enzimáticos para medir el impacto de los compuestos sobre las otras enzimas virales (RT y proteasa), cada enzima requiere su propio sistema de ensayo. El ensayo de vector de ronda, como se describe, puede ser utilizado, sin modificación, para la detección de inhibidores de la RT. Un ensayo similar se puede utilizar para la detección de inhibidores de la proteasa; Sin embargo, en un ensayo de inhibidor de la proteasa, los compuestos deben ser añadidos a las células utilizadas para producir los vectores. Un ensayo relacionados, utilizando diferentes células y vectores, también se puede utilizar para la detección de envoltura (env) y los inhibidores de la fusión de entrada del VIH. Por último, el ensayo se puede usar, en una escala más grande, con dispensadores de automatización robótica. Por lo tanto, el ensayo se puede usar para cribar grandes bibliotecas de compuestos contra WT y mutant VIH. Sin embargo, el hecho de el ensayo puede detectar un inhibidor de la replicación del VIH que actúa en diferentes etapas de los puntos ciclo de vida viral a una limitación en la interpretación de los datos. Por sí mismo el ensayo no define lo que paso en el ciclo de vida está bloqueado por un compuesto. Si surge esta pregunta, se puede resolver mediante el uso de tiempo de los ensayos de adición 38, y probando el compuesto contra las proteínas virales recombinantes purificadas. Lamentablemente, a pesar del éxito de los medicamentos contra el VIH, todavía hay problemas con la resistencia y la toxicidad. En ausencia de una vacuna eficaz contra el VIH, hay una necesidad no sólo para desarrollar nuevos fármacos terapéuticos que serán eficaces contra los mutantes resistentes a los fármacos existentes, sino también para desarrollar fármacos profilácticos que pueden reducir la propagación del virus. Si el uso profiláctico de medicamentos contra el VIH comprende el ámbito del tratamiento de las personas infectadas, este enfoque colocará una carga especial en el desarrollo de fármacos que se tienen loco o nada de toxicidad a largo plazo.

La disponibilidad de las drogas dirigidas a varios pasos esenciales en el ciclo vital del virus VIH-1 ha llevado a la terapia de combinación de drogas (llamada terapia altamente activa antirretroviral, o HAART) que ha mejorado en gran medida el tratamiento de las infecciones por el VIH-1, y la supervivencia a largo plazo de los pacientes. TARGA, que típicamente utiliza combinaciones de dos nucleósidos de la transcriptasa inversa (RT) y los inhibidores ya sea un inhibidor de proteasa o un inhibidor no nucleósido de la RT, ahora se ha convertido una enfermedad mortal en una condición de vida larga 1-5. Sin embargo, a pesar de los muchos éxitos de la terapia HAART en una supresión sostenida de la replicación viral, tiene limitaciones. TARGA no erradica el VIH, por lo que los pacientes no se curan y el tratamiento es de por vida. Hay problemas con la toxicidad del fármaco y con la aparición de cepas resistentes a los medicamentos. La resistencia puede surgir de todos los medicamentos contra el VIH aprobados contra, incluidos los medicamentos recientemente aprobados que se dirigen a la integrasa del VIH (IN). Resistencia a los medicamentos probablemente surge becauso de mutaciones espontáneas que se producen durante la replicación viral (tasa de error de 3 x 10 -5 ciclo de mutaciones / base / reproducción) 6. Cuando surgen mutaciones en los genes que codifican para los objetivos de los fármacos anti retrovirales, un pequeño subconjunto de estas mutaciones dará lugar a una reducción en la susceptibilidad de la cepa viral a los medicamentos. Para evitar el desarrollo de resistencia a los medicamentos, las concentraciones de fármacos deben mantenerse en niveles que suprimen totalmente la replicación del VIH. La mala adherencia al régimen terapéutico agrava el problema y puede conducir a la rápida evolución de la resistencia a 7-9. Aunque las concentraciones de fármaco pueden variar en los pacientes debido a la diferente absorción, metabolismo, distribución, y los niveles de excreción, altas concentraciones de drogas pueden conducir a la toxicidad 10. Puesto que la terapia continua para la vida del paciente, hay serias preocupaciones de seguridad acerca de la toxicidad a largo plazo de los antirretrovirales. Los antirretrovirales utilizados en la terapia HAART puede tener efectos adversos and ha habido incidencias donde los efectos secundarios han sido peligrosa para la vida 11-15. Los problemas de los pacientes se encuentran con el desarrollo de la resistencia y toxicidad subyacen a la necesidad de desarrollar nuevos fármacos que bloquean eficazmente la replicación de las cepas resistentes a los medicamentos comunes del virus con una toxicidad escasa o nula a largo plazo. Por lo tanto, hay una necesidad de un ensayo que puede seleccionar compuestos que bloquean los pasos esenciales en el ciclo de vida viral rápidamente. Aquí se describe un ensayo eficiente que se puede utilizar para evaluar la citotoxicidad de un compuestos y su capacidad para bloquear la replicación de ambos WT y cepas de VIH resistentes a los fármacos rápidamente y de manera eficiente. El ensayo se utiliza es similar a un ensayo que fue desarrollado para la detección de resistencia a los medicamentos en el virus aislado de pacientes 16-18. Aunque el ensayo se puede utilizar sin modificación para la detección de compuestos que pueden bloquear la transcripción inversa del VIH, vamos a describe usando el ensayo para evaluar EN inhibidores. EN es una enzima viral esencial que inserta el ADN viral en el genoma celular 19. Aunque se están desarrollando una serie de prometedores en inhibidores, algunos de los cuales están actualmente en fase de ensayos clínicos, sólo Isentress 20, 21 (también conocido como raltegravir o RAL) y, más recientemente, elvitegravir (EVG) 22 y Dolutegravir (DTG) 23 han sido aprobado por la FDA. Estos compuestos son activos contra el VIH tanto B y subtipos no B en cultivo celular y en los pacientes 24, 25. Sin embargo, el tratamiento con RAL selecciona para resistente a los medicamentos del VIH-1 en los mutantes, incluyendo Y143R, N155H y G140S/Q148H 24, 26-31. N155H y G140S/Q148H también reducen la eficacia de EVG, que hace hincapié en la necesidad de diseñar y desarrollar la segunda generación de los inhibidores de transferencia de cadena (INSTIs) que son eficaces contra estas mutaciones de resistencia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Aunque un número de medicamentos contra el VIH se han aprobado, todavía hay problemas con la toxicidad y la resistencia a los medicamentos. Esto demuestra la necesidad de identificar nuevos compuestos que pueden inhibir la infección por los resistentes a los medicamentos del VIH-1 cepas comunes con una toxicidad mínima. Aquí se describe un ensayo eficiente que se puede utilizar para determinar rápidamente la citotoxicidad celular y la eficacia de un compuesto frente a las cepas virales WT y mutantes. La línea celular diana deseada se sembró en una placa de 96 pocillos, y después de una incubación de 24 horas, se añaden seriada diluciones de los compuestos a ensayar. No hay manipulaciones adicionales son necesarios para los ensayos de citotoxicidad celular; para anti VIH Ensayos de una cantidad predeterminada de cualquiera de un WT o VIH-1 resistente vector de medicamento que expresa luciferasa se añade a las células. La citotoxicidad se midió utilizando un ensayo de luminiscencia dependiente de ATP y el impacto de los compuestos sobre la infectividad se mide mediante la determinación de la cantidad de luciferase en la presencia o la ausencia de los inhibidores putativos. Este ensayo de exploración tarda 4 días en completarse y varios compuestos pueden ser examinados en paralelo. Los compuestos se criban por triplicado y los datos se normalizan a los niveles de infectividad / ATP en ausencia de compuestos diana. Esta técnica proporciona una medición rápida y precisa de la eficacia y la toxicidad de los compuestos potenciales anti-VIH.

Si el ensayo (Figura 1, los pasos 1 y 2) se realizó con éxito, entonces los valores de luciferasa deberían ser similares a los datos presentados en la Tabla 2 explorar a través de la gama de concentración.; un compuesto potencialmente potente revelará aumento de la actividad de la luciferasa de izquierda a derecha, y el control debe tener la mayor actividad de la luciferasa. Si la actividad de la luciferasa no supere 0,1 unidades relativas de luciferasa (RLU) en toda la gama de concentración, esto normalmente indica que el compuesto mató a las células. Si los datos de la luciferasa es mayor que o igual a 2,0 RLU a través de todas las diluciones en serie, a continuación, los compuestos no fueron capaces de inhibir el VIH-1 infecciones a las concentraciones ensayadas. Trazado de la concentración de los compuestos frente a la inhibición de la actividad de la luciferasa por ciento en Kaleidagraf (Tabla 3, parte A), después de realizar el análisis de regresión lineal, se producen resultados similares para t<html> manguera se muestra en la Tabla 3, parte B. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Preparación de VIH-1 reservas de virus y de la configuración de la citotoxicidad celular y Single-ronda Infectividad Los ensayos. En el paso 1, las células 293T se transfectan con pNL4.3ΔEnv.LUC y VSV-G y se incubaron durante 48 h para producir el virus 34 . El virus se recoge y se almacena (congelado a -80 ° C en alícuotas) hasta que se utiliza en los ensayos de infectividad. Para el paso 2, células HOS se siembran en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se incubaron previamente con diluciones seriadas de los compuestos a ensayar durante 3 horas y después se infectaron con el virus (ya sea WT o resistente a las drogas). Después de una incubación de 48 horas, se midió la actividad de luciferasa. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabla 1. Selección de Medicamentos de serie de prototipos de dilución. Un examen más riguroso consiste en 11 diluciones en serie que normalmente se inician a los 10 M y desembocan en 0.0005 M. Las diluciones en serie se preparan 10x; hay 100 l de células y 100 l de virus en cada pocillo). En este volumen y siguiendo estos cálculos, las diluciones en serie serán suficientes para 3 filas de una placa entera de 96 pocillos. Los ensayos de citotoxicidad se preparan de manera similar; sin embargo, las 11 diluciones en serie comienzan en 250 M y terminan a las 0.05 mM. Sólo 11 l de las diluciones se añaden a los pocillos en la placa que contiene 100 l de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabla 2. Lectura de datos de la señal de luciferasa y Determinación del porcentaje de inhibición de la actividad luciferasa. La tabla de datos muestra un conjunto típico de datos de la luciferasa para un compuesto éxito. La tabla también muestra los cálculos adicionales necesarios para determinar el porcentaje de inhibición de la actividad de la luciferasa y la CC 50 e IC 50 valores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabla 3. Análisis de Regresión Lineal tabla de datos. Parte A. Representación gráfica de la gama de concentración utilizada en comparación con el porcentaje de inhibición de la actividad de luciferasa en Kaleidagraf producirá las curvas de inhibición apropiadas. Parte B, Las curvas de inhibición se define por la 3 paramétricofunción sigmoidal y ajuste a los datos mediante análisis de regresión lineal 18. Esta tabla de datos se utiliza en conjunción con Microsoft Excel para calcular las concentraciones de fármaco necesaria para inhibir el virus de la integración y la citotoxicidad celular en un 50%, por ejemplo, IC 50 y CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K vistas.  National Cancer Institute.  Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas. 

Video: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Investigación

Inmunología e Infección

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.