Agradecemos a Sandra Bargen para el apoyo técnico excelente. Este trabajo fue apoyado por el departamento de investigación de proteínas (PRD, PT A1.2 (RC y TS), y la investigación RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK), los anticuerpos monoclonales y 39.4D5 F55A10 se obtuvieron a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Para los reactivos especiales: ver Tab. 1. Todos los demás reactivos se enumeran en la calidad del grado de cultivo de células obtenidas de Sigma Aldrich. 1. PORN-H/laminin recubrimiento de platos / cubreobjetos <ol><li> Prepare una solución de trabajo de 0,5 mg / ml de poli-DL-ornitina bromhidrato (PORN-H) en 150 mM pH de borato 8,35. <ol><li> Una solución stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampón borato se pueden preparar con antelación y almacenadas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Esterilizar cubreobjetos de vidrio de fuego en el 100% de etanol y dejar secar al aire. </li><li> Cubrir la superficie con suficiente PORN-H solución de la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, lavar tres veces con agua esterilizada y cubreobjetos se seque al aire. </li><li> Prepare una solución de trabajo de 2,5 mg / ml laminina en HBSS <ol><li> Alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C. Descongelar a 4 º C inmediatamente antes de su uso. </li></ol></li><li> Cubra la superficie de los cubreobjetos PORN-H-cubierto con la solución de laminina y dejar que ellos se incuba durante al menos 2 horas a temperatura ambiente hasta su uso. </li></ol> 2. Recubrimiento de lectina de la purificación de placas <ol><li> Prepare una solución de 10 mM Tris en agua esterilizada, pH 9,5. </li><li> Añadir lectina (resolver la lectina (Sigma L9640) en polvo en HBSS) a una concentración final de 10 mg / ml. </li><li> Cubrir la superficie de una placa de cultivo celular de 10 cm con 8 ml de la solución de lectina y se deja incubar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la placa tres veces con HBSS y almacenar en HBSS hasta su uso. </li><li> Prepare un 30 mM KCl, 0,8% (w / v) NaCl despolarización solución. Esterilice por filtración y almacenar a temperatura ambiente (TA). </li></ol> 3. Motoneurona medio de cultivo <ol><li> Descongelar el suero de caballos durante la noche a 4 ° C e inactivar a 55 ° C durante 30 minutos, en alícuotas de 5 ml y almacenar a -20 ° C. Alícuota descongelar directamente antes de su uso a temperatura ambiente. </li><li> Tienda B27-suplemento en un aliqouts ml a -20 ° C. Descongelar a temperatura ambiente B27 suplemento inmediatamente antes del uso. Evitar ciclos de congelación y descongelación. </li><li> Glutamax alícuota en alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -20 ° C y uso en 1:100. </li><li> Prepare una solución stock de 10 mg / ml CNTF en agua esterilizada con 0.1% de BSA. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Mezcla de 46 ml de medio neurobasal con 2,5 ml de suero de caballos, 1 ml B27-complemento y 0,5 ml glutamax directamente antes de su uso. </li><li> Añadir CNTF a una concentración final de 10 ng / ml de medio y medio de pre-calentamiento a 37 º C. </li></ol> 4. La disección de la médula espinal <ol><li> Sacrificar un ratón E12.5 embarazada y la toma de embriones con cuidado. Añade suficiente HBSS RT para cubrir completamente los embriones. </li><li> Quitar la cabeza y la cola y el lugar de la parte posterior del embrión con los miembros a horcajadas. </li><li> Fijar el embrión con un fórceps y quitar la piel exterior con las pinzas de otros. </li><li> Eliminar la médula espinal por la perforación de las pinzas bajo, y la levante con ver como los movimientos en ambos lados de la médula espinal. </li><li> La transferencia de la médula espinal aislada de un nuevo plato con HBSS y abrir el canal central de la médula espinal en la parte dorsal. </li><li> Quitar los ganglios de la raíz dorsal mediante la eliminación de las meninges envolvente de la médula espinal. </li><li> Reúne las piezas lumbar de la médula espinal de un máximo de 6 embriones por placa de lectina en un tubo eppendorf reacción llena de un HBSS ml y almacenar en hielo hasta que la preparación se lleva a cabo. </li></ol> 5. Enriquecimiento de las motoneuronas por lectina basado en la purificación Nota: Antes de comenzar los pasos a seguir, la última que le preparan y precalentar el medio (ver paso 3). <ol><li> Prepare una solución de tripsina por la solución de 1 g de tripsina en 100 ml HBSS, almacenar a -20 ° C y descongelar a 4 ° C. </li><li> Mezclar 1 g de tripsina inhibidor con 98 ml de HBSS y 2 ml de 1 M pH 7,4 HEPES, alícuotas de 1 ml deben ser almacenados a 4 ° C. </li><li> Transferir el tubo con la médula espinal a una campana de cultivo de células y retirar con cuidado 700 l de la HBSS. </li><li> Añadir 7,5 l de solución de tripsina y mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo. </li><li> Realizar tripsinización durante 8 minutos a 37 ° C. </li><li> Detener la reacción añadiendo 30 l inhibidor de la tripsina y la pipeta hacia arriba y hacia abajo (triturar) cuidadosamente 10-15 veces con una pipeta 1.000 l hasta que no haya más agregados de células son visibles. Repita la trituración con una pipeta de 20 a 200 l, y la punta correspondiente. </li><li> Pipeta la solución de células en la placa de lectina HBSS y lleno de dispersar las células suavemente girando el plato. </li><li> Guarde la placa de la lectina de 60 min a temperatura ambiente sobre una superficie libre de vibraciones. Cúbralo para evitar la contaminación. </li><li> Retire la HBSS muy suavemente y se lava la placa con cuidado 4 veces con pre-calentado HBSS para eliminar fragmentos de células y las células no se adjunta / solteras. </li><li> Inmediatamente después de la última etapa de lavado, añadir 500 l solución de la despolarización de la placa y se deja incubar durante 1 minuto. </li><li> Facilitar el desprendimiento de las células de la lectina obligado por agitación ytocando la placa. </li><li> Llenar el plato con 2 ml de medio de la cultura pre-calentado y transferir a un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Contar el número de células con una cámara de recuento Neubauer. </li><li> Placa de la celda de la laminina cubreobjetos recubiertos o placas en un número adecuado dependiendo de la aplicación. </li><li> Realizar un intercambio de soportes en el día 1 y, posteriormente, cada dos días por el reemplazo cuidadoso de un 50% de la mediana edad. Utilice siempre pre-calentado, medio recién preparado una nueva cultura. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Motoneuronas embrionarias se pueden obtener de embriones de ratón en el E12 a E14. 2.3% de la población total de células de la médula espinal lumbar consiste en neuronas motoras y, como las neuronas ganglionares raíz dorsal se p75 NTR-positivas, así, es importante para deshacerse de estas células antes de iniciar el procedimiento preplating lectina basado en ( Para información general véase la Figura 1 y Figura 2). En segundo lugar, las meninges son las células con fuerza divisoria que debe ser excluido, así, ya que no pueden ser eliminados correctamente por el procedimiento basado en preplating lectina (Figura 2 y Figura 3). En el peor de los casos, estas células pueden crecer demasiado las placas de cultivo. Las imágenes de representación en la figura 3B y 3D también dar una impresión acerca de la densidad celular más baja después de los procedimientos de lavado se han realizado (véase el paso 5.9 del protocolo). Los cultivos de motoneuronas embrionarias de ratón son por lo general se mantiene hasta para cinco o siete días. Durante este período de tiempo las células establecer sus axones hasta una longitud máxima (Figura 4). Longitudes de las neuritas, dependen fuertemente del sustrato en el 8 placas. El sustrato típico es la laminina, que se aplica sobre PORN-H placas de cultivo cubierto. Motoneuronas también puede crecer en otros sustratos o menos definidas, como las matrices extracelulares generados por la lisis del agua 8. En los casos de recubrimiento óptimo de longitud, las neuritas y el área del cono de crecimiento se redujo y la muerte celular por lo general aumenta. Soporte trófico juega un papel crucial para la supervivencia de las motoneuronas de embriones de ratón en cultivo. Supervivencia de las células inicialmente plateado en el día siete caída de 10% a 20% sin el apoyo trófico 6. Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) son los factores más comúnmente utilizado, pero otros pueden promover la supervivencia, así [el factor inhibidor de leucemia (LIF), cardiotrofina-1 (CT-1), factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF ), similar a la insulina factor de crecimiento 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo esquema para la preparación de las neuronas motoras de embriones de ratón. El esquema ilustra los diferentes pasos para el aislamiento y la cultura de las neuronas motoras de embriones de ratón. Abreviaturas: SC: la médula espinal; HBSS: solución salina equilibrada de Hanks, MN: motoneurona. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> Figura 2 El aislamiento de la parte lumbar de la médula espinal de ratón E12.5 A:.. E12.5 embrión de ratón. Para el siguiente paso, la cabeza y la cola se eliminan y el cuerpo es colocado en una posición dorsal B-up: Embrión en posición dorsal-up. Pinzas en la parte izquierda y derecha de la médula espinal son la fijación del cuerpo del embrión en su posición. Uno de los fórceps se utilizan posteriormente para cortar la piel y cortar debajo de la médula espinal de la otra se utiliza para fijar el embrión en su posición C:. Médula espinal aisladas de embriones de ratón E12.5. Las partes de la médula espinal (cervical, dorsal, lumbar) se indican. La médula espinal está rodeada por las meninges y parte de los ganglios de la raíz dorsal todavía se adhieren a ellas D:. La médula espinal es cortada longitudinalmente en la parte dorsal para abrirla hacia el canal central E:. Las meninges en la cara ventral están tomadas de la médula espinal aplanado. Nota: Aunque retirado, la región lumbar se caracteriza por un pequeño corte. F: Sólo la parte lumbar de la médula espinal es llevado por otros procedimientos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> Figura 3 Determinación y aislamiento de islotes de células positivas a partir de la médula espinal lumbar de E12.5 embriones de ratón A:.. Las etiquetas Islet-1 / 2 de anticuerpos columnas de las motoneuronas en la médula espinal lumbar embrionarias (rojo, flecha) y las etiquetas de todos los Hoechst núcleos dentro de la sección. Sección transversal de un cable de E12.5 lumar espinal. E12.5 embriones de ratón se fija inmersión en paraformaldehído al 4% durante 6 h, se lavaron 3 veces con tampón fosfato salino y tratados con sacarosa de acuerdo con los procedimientos estándar. Cryosections de 20 micras fueron tomadas con un criostato y las secciones se manejan para la tinción immunhistochemical de acuerdo con los procedimientos estándar de 11. El software posteriormente las secciones marcadas con Hoechst para la localización de los núcleos celulares. Tenga en cuenta quelas neuronas ganglionares raíz dorsal se Islet-1/2-positive así y que el procedimiento de preparación no incluye esta parte de tejido del procedimiento de aislamiento B:. Islet-1 / 2 etiqueta (rojo, flecha) disociar las células de la médula espinal lumbar de E12. 5 embriones, a la izquierda - y antes de la derecha - después de lectina basado preplating. Las células fueron contrastados con Hoechst para visualizar todos los núcleos de las células C:. Cuantificación de células Islet-1/2-positive antes y después de lectina basado preplating D:. Nkx6.1 motoneuronas etiqueta de E12.5 embriones después de un día en la cultura. Las células fueron contrastados con Hoechst para cisualieze todos los núcleos. Tenga en cuenta que el 90% de todas las células son Nkx6.1 positivo. Abreviaturas: SC: la médula espinal, MN: motoneurona; DRG: ganglio de la raíz dorsal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> Figura 4 Caracterización de las motoneuronas E12.5 ratón A y B:.. Enriquecido aislados E12.5 ratón lumbar motoneuronas espinales expresar p75 NTR a 0 días in vitro (0div) y el día 2 in vitro (2DIV). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y posteriormente teñidos para p75 NTR acuerdo con los procedimientos estándar. Las células fueron counterstained con Hoechst para visualizar todos los núcleos de C:. Motoneuronas enriquecido después de 5 días in vitro (5div) en el PORN y la laminina-H como sustratos de cultivo y en la presencia de manchas CNTF de β-III-tubulina. Tenga en cuenta que las células han desarrollado a partir neuritas largas y mostrar la morfología típica de las motoneuronas con un tiempo (ramas) del proceso y uno o más procesos más cortos (axones y dendritas). Abreviaturas: MN: motoneurona, div: días in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Después de la disociación, sin lectina basado preplating </td></tr><tr><td> Número total de células / SC </td><td> El azul tripán de células positivas [%] </td><td> Islet-1/2- células positivas [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995.0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889.4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Media ± DE </td><td> 1.021.0 ± 147,1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Con lectina basado preplating </td></tr><tr><td> Número de células después de preplating / SC </td><td> El azul tripán de células positivas [%] </td><td> Islet-1/2- células positivas [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189.6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168.8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125.0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Media ± DE </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de resultados de los procedimientos de aislamiento representante de las neuronas motoras de embriones de ratón de la etapa E12.5. A partir de 3 diferentes procedimientos de aislamiento especialmente para este fin se dan como el número total de números o porcentaje ± SD. Abreviatura: SC: la médula espinal; SD: desviación estándar. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 células positivas a p75 paneo [%] </td><td> Islet-1 / 2 células positivas con lectina basado paneo [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Resultados de la comparación de la lectina base y p75 basada en un encuadre números de las motoneuronas de la célula. Se dan los números de porcentaje ± SD.

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	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La ventaja de esta técnica basada en preplating lectina es que es menos costoso que el p75 NTR un procedimiento basado en paneo, y la lectina es más estable que los anticuerpos. El enriquecimiento que figuran en la figura. 2 y Tab. 1 muestra que el procedimiento permite a la purificación de un número similar de células y que la mayoría de estas células expresan el marcador de las motoneuronas Islet-1 / 2. El paso más crítico es el procedimiento de aislamiento de la médula espinal lumbar. La eliminación de las meninges y el GRD (Fig. 2) es esencial para el procedimiento de purificación después de lectina basado preplating. Si esto ha sido manejado correctamente, casi todas las células expresan el p75 NTR (para la imagen representativa ver fig. 3a). La razón de la diferencia entre la expresión de Islet-1 / 2 y p75 NTR es muy probablemente debido a las motoneuronas lumbar expresan diferencialmente los niveles superior e inferior de Islet-1 / 2 10. En el caso de los bajos niveles de Islet-1 / 2 esta expresión podría haber escapado a nuestra atención en la tinción immuncytochemical y contando posteriores a medida que eran estrictos con respecto a las células positivas frente a los negativos (Tabla 1). Además, el cuadro 1 muestra claramente que las células aisladas sobreviven al procedimiento en una condición saludable, ya que sólo hay unos pocos tripán azul células positivas que indican que las células son irreversiblemente dañados. Este procedimiento alterativo también permite el aislamiento de las neuronas motoras a partir de embriones individuales y por lo tanto, de camadas mixtas genotipo de ratones embrionarios. En conclusión, esta alternativa al procedimiento de la panorámica con el anticuerpo p75 NTR 6 tiene similares si no idénticas capacidades en términos de rangos de posible aplicación y proporciona un método alternativo de purificación barato y eficiente para las motoneuronas embrionarias de ratón.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitina bromhidrato </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 o 14 mm </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta superficie </td></tr><tr><td> Suero de caballo </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Cada lote tiene que hacerse la prueba de MN cultura </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td></td><td></td><td> De acero inoxidable, tamaño 4 o 5 </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Sobrenadante del cultivo celular </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Sobrenadante del cultivo celular </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> La tabla 3. Tabla de reactivos y equipos específicos.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Motoneuronas espinales evolucionar hacia estadios postmitóticas hasta principios de desarrollo embrionario del sistema nervioso y, posteriormente, crecen las dendritas y los axones. Células neuroepiteliales del tubo neural que expresan Nkx6.1 son las únicas células precursoras de las neuronas motoras espinales 1. A pesar de las motoneuronas postmitóticas avanzar hacia su posición final y se organizan en columnas a lo largo del tracto espinal 2,3. Más del 90% de todas estas motoneuronas diferenciado y posicionado expresar los factores de transcripción Islet 1 / 2. Que inervan los músculos de las extremidades, así como las del cuerpo y los órganos internos. Entre otras, las neuronas motoras suelen expresar los receptores de alta afinidad para el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la neurotrofina 3 (NT-3), la tropomiosina relacionadas quinasa B y C (TrkB, TrkC). Ellos no expresan la quinasa tropomiosina relacionados A 4 (TrkA). Junto a los dos receptores de alta afinidad, las motoneuronas no expresan la baja afinidad por los receptores de neurotrofinas p75 NTR. El p75 NTR puede unir a todos neurotrofinas con afinidad similar, pero menor a todas las neurotrofinas que los receptores de alta afinidad que se unen las neurotrofinas maduras. Dentro de la médula espinal embrionaria, la p75 NTR se expresan exclusivamente en las neuronas motoras espinales 5. Esto ha sido utilizado para desarrollar técnicas de aislamiento de las motoneuronas para purificar las células de la gran mayoría de las células que rodean 6. Motoneuronas aislar con la ayuda de anticuerpos específicos (panning) en contra de los dominios extracelulares de p75 NTR ha resultado ser un método costoso como la cantidad de anticuerpo utilizado para un solo experimento es alta debido al tamaño de la placa utilizada para el desplazamiento lateral. Una alternativa mucho más económica es el uso de lectinas. Lectina se ha demostrado que se unen específicamente a p75 NTR y 7. El método siguiente describe una técnica alternativa utilizando aglutinina de germen de trigo por un procedimiento preplating en lugar de los anticuerpos p75 NTR. La lectina es una alternativa muy económica para el anticuerpo p75 NTR y los grados de purificación utilizando lectina es comparable a la de los anticuerpos p75 NTR. Motoneuronas de la médula espinal de embriones puede ser aislado por este método, sobrevivir y crecer neuritas.

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.

Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K vistas.  Ruhr-University Bochum. Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...