Los autores agradecen a Dan Bess de Sigma-Aldrich para la presentación del video. También queremos agradecer a Don Branch, Cherny Evgenii, Chesla Scott, Hadac Elizabeth Harrison Amanda, Heathcote Damien, Hult Annika, Lan Chuan-Ching, McIntosh Susannah, Komarraju Sarvani, Korchagina Elena, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Rodinov Igor, Alexander Tuzikov, y Eleanor Williams por sus resultados y sus contribuciones al diseño, la síntesis de las construcciones de FSL y la determinación de la actividad biológica.

El siguiente protocolo describe el procedimiento genérico para la inserción de las construcciones de FSL (Figura 1) en las membranas biológicas. Para simplificar el protocolo sólo hace referencia a las células (kodecytes), que se encuentran en una concentración del 100%. Sin embargo, las células término es intercambiable con los viriones (kodevirions) o de los organismos o estructuras celulares y su concentración en el diluyente no es importante, siempre que sea siempre coherente entre las pruebas, controles, y los experimentos. Con los glóbulos rojos el hematocrito es típicamente 80%, pero con viriones, los embriones y otras células que normalmente es menos del 1%. El método es muy robusto y se producen las membranas modificadas cuando es utilizado por cualquiera de sus variantes, pero el refinamiento se requieren para optimizar y estandarizar el grado de modificación requerida para aplicaciones específicas. 1. Preparación de la FSL Construye <ol><li> Para preparar la FSL acciones construcción reconstituir la primera solución del producto seco FSL (Tabla 1) con la adición de 1.0 mL de diluyente (o como se especifica en el prospecto del producto) para el vial del producto. En pocas palabras ultrasonidos (30 segundos). Esto permitirá preparar una solución de 1mg/ml, que puede ser alícuotas en 100 contenedores estériles l y se almacena a 2-8 ° C durante un máximo de una semana, o congelar hasta por 3 meses. </li><li> Para preparar el trabajo FSL construir soluciones para la inserción, justo antes de usar brevemente ultrasonidos (30 segundos) la solución de reserva para homogeneizar cualquier micelas. Diluir la construcción de FSL en tampón (preferentemente que no contengan lípidos o material altamente hidrofóbicas) a la concentración requerida o en un rango si se desea. </li></ol> Notas: <ol><li> FSL construye por lo general se inserta en las células que contienen lípidos en los medios de comunicación, pero por lo general se requieren hasta 50 veces mayores concentraciones FSL de trabajo que si en PBS u otro medio libre de lípidos. </li><li> Las diluciones área de trabajo dependerá de la aplicación, la sensibilidad de detección del método, el tipo de construcción de FSL, y el grado de modificación requerida. Normalmente, el rango de dilución será de entre 10 a 500 mg de FSL por ml de diluyente para los hidratos de carbono construye FSL y 100-100 mg / ml para otras construcciones de FSL como fluoróforos y biotina. </li><li> Si la preparación de diluyentes de inserción que contiene múltiples construir FSL, sólo tiene que añadir las construcciones en conjunto en el mismo diluyente en su concentración normal de trabajo. Si una construcción está en una concentración mucho más alta que otra, algún tipo de ajuste (aumento) de la concentración puede ser necesario para la construcción menor. Por otra parte las construcciones se pueden añadir de forma secuencial, de preferencia con la mayor concentración de construir en primer lugar, seguido por el menor. </li><li> FSL concentraciones de construir por encima de 1000 mg / ml puede introducir importantes cantidades de lípidos en la membrana celular, y puede cambiar la forma de la célula o los hacen más susceptibles a la lisis. </li><li> FSL construir soluciones de trabajo deben ser almacenados a 2-8 º C y utilizarse dentro de unos días. </li><li> Construye FSL se puede diluir en agua, pero se han reducido y la estabilidad debe ser utilizado en cuestión de horas. Si el prospecto especifica el agua como diluyente de la reconstitución del producto en el vial también contiene sales (como se especifica en el prospecto). </li></ol> 2. La inserción de FSL Construir (s) en las membranas <ol><li> Primero se deben lavar las células de FSL libre modificación de lípidos no unido por centrifugación y el uso de PBS o lípidos medios libres de células como la solución de lavado. </li><li> Paquete de las células o suspender en 100 l de diluyente. </li><li> Al mismo tiempo, preparar los controles que idealmente debería ser a la vez las células no modificadas (incubadas con PBS en lugar de solución FSL) y / o células modificadas con un tumor benigno, pero relacionados con la construcción de FSL. </li><li> Añadir 100 ml de una dilución apropiada de FSL solución (que contiene una o más construcciones FSL) a las células e incubar durante 1-2 horas a 37 º C. Un resultado similar se puede conseguir por 6 horas de incubación a 25 ° C o durante la noche (18 horas) a 4 ° C - la mezcla se recomienda cada pocas horas, si las suspensiones de células grandes se utilizan. </li><li> Lavado (opcional) dos veces con PBS o medios para eliminar las construcciones libres FSL y preparar una suspensión apropiada. </li></ol> Notas: <ol><li> El diluyente utilizado para suspender las células pueden ser medios de cultivo celular, PBS, las soluciones de células de almacenamiento, etc, pero de preferencia sin lípidos (por ejemplo, el suero bovino fetal) o detergentes (por ejemplo, Tween). </li><li> Diferentes volúmenes (de 100 l) ratios (de 1:01 células / solución FSL) o las condiciones de incubación de la hora y la temperatura se podrán utilizar siempre la misma proporción, la concentración y el volumen se utilizan para obtener resultados reproducibles. </li></ol> 3. Manejo y visualización <ol><li> Una vez que el proceso de modificación de FSL se ha completado la kodecytes puede ser almacenado a 4-8 ° C en los lípidos de los medios de comunicación libres o usado. </li><li> Kodecytes y kodevirions general, se comportan igual que las células no modificadas / viriones y puede ser Handled y se observa bajo sistemas de prueba normal (microscopía, serología, citometría de flujo, etc.) Por lo general, no tienen requisitos especiales, excepto para la prevención de solventes / detergentes / lípidos que pueden eluir las construcciones de los lípidos de las membranas. </li></ol> Notas: <ol><li> Construcciones permanecerán en la membrana de las células inactivas, tales como glóbulos rojos, si se almacena en los lípidos medios de comunicación libres para la vida de la célula. En las células con membranas activas de las construcciones será interiorizado y se metaboliza, a una velocidad dependiente de la actividad de la membrana celular. </li><li> Las células muertas por lo general contienen altos niveles de las construcciones de FSL, lo que puede ser usado para separar las células no viables a partir de células viables. </li><li> Si kodecytes se almacenan (o su uso en vivo) en los lípidos que contienen los medios de comunicación / medios, como el suero / plasma la construcción poco a poco se eluyen de la membrana durante un período de horas o días, dependiendo de la temperatura y las concentraciones de lípidos / composiciones. </li></ol> 4. Los resultados representativos: <ol><li> Los resultados representativos siguientes dependen de la construcción utilizada (Tabla 1), su concentración insertado y la sensibilidad y especificidad del sistema de detección (s). En general todas las construcciones FSL se insertará en las células después de 1 hora, pero las condiciones óptimas que deben establecerse para cada situación. </li><li> Construye FSL puede ser utilizada para etiquetar el exterior de una variedad de células vivas 3-9,11,14. En los ejemplos mostrados en la Figura 2 embriones en diferentes etapas se utiliza (ya que son una célula frágil), pero otras células (Figura 3) o viriones envueltos (Figura 4) también se pueden etiquetar. FSL-fluoresceína permite el marcado directo de las superficies (figuras 2-4), mientras que FSL-biotina y otras construcciones FSL pueden requerir el uso de un sistema de detección de secundaria (por lo general avidina / anticuerpos / lectinas) para mostrar su presencia (Figura 5) . </li><li> Marcadores de grupo sanguíneo de la especificidad humana o animal puede ser conectado a las células, incluyendo células rojas de 4-9 (Figura 6). Como la cantidad de FSL construir en un kodecyte es controlable y reproducible por 4-6, para la cuantificación de anticuerpos kodecytes se puede hacer (Cuadro 2 y Gráfico 6). La fuente real de las células no es importante, que puede ser cualquier especie, o incluso del mismo origen como fuente de anticuerpos, lo que garantiza en el antígeno sólo es incompatible es el establecido por la FSL 7,8 (Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabla 2" /> Tabla 2. Representante de las reacciones serológicas de tres diferentes FSL-A (tri) kodecytes de glóbulos rojos a prueba en contra de las diluciones de anticuerpo monoclonal anti-A. La solución de 50 mM de FSL-A (tri) cuando se incubó con un volumen igual de grupo O glóbulos rojos producido un fuerte células antígeno positivo, lo que podría ser detectado por una dilución 1:512 de anticuerpo monoclonal anti-A. El 5 - y 10 veces menor FSL-A (tri) las soluciones producidas kodecytes con grupo sanguíneo A menos la expresión del antígeno. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL construir visión" /> Figura 1. FSL construcción general. Como una flor construye FSL consta de tres componentes principales. El jefe funcional (F) en el caso de la construcción FSL puede ser una variedad de diferentes grupos biológicamente funcionales, un espaciador (S) diseñada para inducir el espaciamiento de los F de la membrana, mejorar la capacidad de dispersión de agua y que no son reactivos con suero, mientras que los lípidos diacil permite la construcción de incorporar de manera espontánea en la superficie. (I) FSL-GB3 con un grupo sanguíneo Gb 3 (o P k) trisacárido Galα4Galβ4Glcβ epítopo. (II) FSL-A (de tres) con un grupo sanguíneo A, trisacárido epítopo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceína. (IV) FSL-biotina con una fracción F solo biotina. El grupo funcional de las estructuras de I-III se conjugan con un derivado activado de adipato dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), mientras que el separador de la estructura IV es carboxymethylglycine-adipato de base. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-fluoresceína embriones murinos" /> Figura 2. FSL-fluoresceína embriones murinos. Todas las imágenes son de embriones vivos que fueron etiquetados en su zona pelúcida (ZP) estaba intacto (es decir, la construcción de FSL pasa a través de la ZP a la etiqueta del embrión en el interior). Imágenes I-IV son de ZP sin embriones liberados de sus ZP con el etiquetado mensaje ácido Tyrodes con FSL-fluoresceína. Tinción idéntico se produce independientemente de si los embriones se FSL modificado con ZP intacta o sin ZP. Los embriones son directamente etiquetados con FSL-fluoresceína, por el de 2 horas 37 ° C en el método de medio libre de suero de cultivo de células, se lavan y luego se observan bajo el microscopio de fluorescencia. (I) ZP libre de dos células de embriones murinos, que también muestra clásica de una intensa coloración del cuerpo polar. (II-III) ZP libre de cuatro células y embriones de ocho células murinas, tanto mostrando manchas oscuras de las células que son salidaside el microscopio plano de enfoque. (IV) ZP 16 libre de células murinas embrión. (V) ZP intacta embriones murinos blastocisto (d4-d5), donde se marcan tanto el embrión y la zona. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-fluoresceína y el pez cebra" /> Figura 3. FSL-fluoresceína y el pez cebra 14. (I) Microangiography en larvas de pez cebra 52 HPF (fertilización horas después) se inyecta directamente en la circulación con FSL-fluoresceína. El pez cebra vasculatura está manchada. (II) FSL-fluoresceína heterogéneo pez cebra las células del tejido del riñón (ZK kodecytes) fueron creados ex vivo después de la micro-inyectados en la circulación de un pez cebra 52 HPF destinatario. En las observaciones in vivo de la kodecytes ZK se hizo hace 2 horas después de la inyección por la imagen de la vasculatura en fluorescencia con microscopía lapso de tiempo. Se muestra un fotograma de vídeo con células grandes de lento movimiento o inmóvil (se indica con flechas de color naranja) y células que se mueven rápido (imágenes borrosas debido al movimiento - se indica con flechas verdes). Etiquetado permite en tiempo real en la observación in vivo de la conducta y la biodistribución kodecytes ZK. (III) la absorción oral de la FSL-fluoresceína logra mediante la inmersión en embriones de pez cebra FSL-fluoresceína que contiene los medios de comunicación para un máximo de 5 días. El lavado se logra mediante la transferencia de embriones en los medios de comunicación que no contiene construcciones FSL (por lo menos 6 horas es necesario, pero puede ser por varios días). (IIIa) microscopía de campo brillante del pez cebra FSL-fluoresceína tratado correspondiente a la imagen al lado de fluorescencia (IIIb). La fluorescencia se encuentra preferentemente en el tracto intestinal. No se observó tinción en los embriones de control sin tratamiento (IVa y IVb). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-fluoresceína etiquetado de los viriones" /> Figura 4. FSL-fluoresceína etiquetado de los viriones 10 VSV y H1N1. (I) el virus de la estomatitis vesicular (VSV) fue etiquetado directamente con 10 mg / ml FSL-fluoresceína durante 2 horas a 37 ° C, seguido de la fijación con paraformaldehído al 4% y citometría de flujo. No purificación de la VSV kodevirion mensaje FSL etiquetado era necesario. (II) La citometría de flujo de cerdos infectados con células testiculares humanas A Rico/8/1934 / Puerto A (H1N1) kodevirions etiquetados con FSL-fluoresceína. Las células no infectadas se ven como negro, mientras que la línea de fusión de las kodevirion H1N1 con los resultados de las células ST en una celda de fluorescentes (línea roja). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-biotina células marcadas" /> Figura 5. FSL-biotina células marcadas y posterior visualización a través de la etiqueta avidina 7,8. Todas las células se marcaron primero con FSL-biotina durante 1 hora a 37 ° C, lavados reaccionó con fluoróforo marcado avidina, lavado y húmedo montadas para microscopía de fluorescencia. (I) Elaboración de imagen confocal de un blastocisto embrionario murino. (II) Central confocal parte del embrión a partir de la imagen anterior. (III) en vivo espermatozoides móviles humanos - desenfoque se produce como consecuencia de su movimiento. (IV) Fijo (paraformaldehído al 4% después de la inserción) los espermatozoides humanos. (V) de eritrocitos humanos. (VI) fija (4% paraformaldehído pre-inserción) RL95 carcinoma endometrial humano. (VII) no fijadas RL95 endometrial carcinoma de líneas de células humanas. (VIII) Biotina RBC kodecytes observado en una muestra de sangre tomada 2 horas después de la infusión intravenosa de kodecytes con (VIII), que representan un campo se observa bajo microscopio de luz, mientras que (VIIIb) es el mismo campo se observa bajo la fluorescencia, la identificación de los dos kodecytes presentes en el campo de vista. El cálculo del coeficiente de kodecytes a las células sin etiqueta se puede utilizar como un indicador de la supervivencia. (IX) en vivo humanos kodecytes biotina endometrial visualizarse mediante la unión a cuentas avidinylated. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-hidratos de carbono para agregar marcadores de grupo sanguíneo de perfiles serológicos" /> Figura 6. FSL-hidratos de carbono para agregar marcadores de grupo sanguíneo de perfiles serológicos. (I) de glóbulos rojos humanos kodecytes Galili fueron creados con una concentración conjunto de FSL-Galili (500 mg / mL) y se verifica a diluciones de suero humano. Glóbulos rojos humanos no ocurren de manera natural con el antígeno xenoantigen Galili. Kodecytes tales se pueden utilizar para los niveles cuantitativos de anticuerpos en el suero. En este ejemplo, el donante se determinó que un título de anti-Galili de 1:32. (II) Mediante la creación de kodecytes con niveles decrecientes de FSL (&quot;los títulos de antígeno&quot;), un nivel óptimo de antígeno para la detección de anticuerpos se puede determinar (en este ejemplo, Le a). Las células se pueden crear con sólo dar un resultado positivo cuando el nivel de anticuerpos superior a un título específico. El nivel de antígeno FSL para dar un resultado positivo depende de la calidad y el nivel de anticuerpos que se detectan. Para los antígenos de hidratos de carbono, una solución FSL de 100 mg / ml por lo general se traducirá en una reacción positiva fuerte. (III) humanos del grupo O glóbulos rojos fueron modificados para tener un nivel específico de una hormigaigen (estandarizado A kodecytes), y se utiliza para cuantificar con precisión y reproducibilidad anti-A en el suero humano. En este ejemplo, el anti-A título en el grupo O de suero analizadas es 01:32 y la kodecytes fueron preparados a partir de las propias células rojas del donante. (IV) Grupo sanguíneo A y B simultáneamente antígenos se inserta en un único grupo de muestras de células rojas O se utilizan para crear un kodecytes B débil débil. Estos kodecytes puede ser utilizado para fines de control de calidad ABO. Este resultado muestra el análisis de una formula específicamente un kodecyte B débil débil probado con reactivos anti-A y anti-B y da espera que las reacciones débiles.

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Deborah A. Blanco y Stephen M. Henry son los empleados y los accionistas de la biotecnología KODE limitado el titular de la patente de la tecnología de KODE. Dan Bess es un empleado de Sigma-Aldrich, que ha patrocinado la producción de este video-artículo.

Modificación de las células y los viriones con las construcciones de FSL es una técnica muy simple y robusto 3.11. Para describir y distinguir FSL construir células modificadas y los viriones de las células no modificadas, se les llama kodecytes y kodevirions respectivamente 6.10, pero sólo cuando el grupo presentó funcional puede ser demostrado que está presente en su membrana. Cuando kodecytes se hacen con diferentes concentraciones de construcciones de FSL, que pueden hacer referencia a la concentración de la solución de FSL construcción utilizada para crearlos, por ejemplo, 15 mg / ml A kodecytes, o si más de un FSL se utiliza entonces un término combinado, por ejemplo, A + biotina kodecytes 7,8. Cuando las células diferentes se van a comparar, incluyendo el tipo de célula en la descripción se recomienda, por ejemplo, rojo kodecytes celular biotina o biotina kodecytes endometrial 7,8. Aunque el proceso de inserción es muy robusto y de inserción (aunque con diferentes ritmos) se producirá en un amplio rango de temperatura 4-37 ° C y en cuestión de minutos a horas, para obtener un control estricto de la inserción reproducible tiempo de contacto, temperatura, concentración de FSL ( incluida la formulación de diluyente), y una concentración menor medida células son obligatorios. Hasta la fecha, todas las construcciones FSL se puede utilizar para modificar las células con la misma técnica 4.11, sin embargo se espera que ciertas condiciones serán más favorables para el flujo de trabajo y / o los requisitos de manejo óptimo de las células / viriones que ser modificado . La hora exacta de la concentración de FSL para lograr el efecto deseado debe ser determinada por el usuario 4. La resultante FSL construir células modificadas / viriones generalmente se pueden utilizar en la misma forma que una célula sin modificar / virión en los sistemas biológicos o de análisis 11.4. A medida que la construye poco a poco FSL elución de superficies modificadas en contacto con soluciones de lípidos 7,8, o ser consumido por las células activas 11, estas cuestiones deben considerarse en relación con el nivel de señal o de actividad obtenidos en períodos de tiempo. Kodecytes puede ser fija (por ejemplo, glutaraldehído / formalina) después de la inserción siempre que el fijador no contiene lípidos liberador de solventes y el grupo funcional es compatible con el fijador. Por otra parte las células fijas se pueden modificar con las construcciones de FSL. Además de la modificación de la superficie celular y virión construye FSL también puede ser infundida directamente en la circulación de animales de laboratorio que causa en la modificación in vivo de células circulantes 7 y para inhibir el virus 12, toxinas, 12 y anticuerpos 7. Construye FLS también se han utilizado para decorar los liposomas y se pueden imprimir en 13 superficies de papel, donde se inmovilizan, y puede ser utilizado en ensayos de diagnóstico. La capacidad de modificar fácilmente las células vivas con un número creciente de construcciones FSL debe ser una investigación útil y una herramienta de desarrollo para el estudio de la biología de la superficie celular.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. Construye FSL disponibles en el mercado se describe en este documento.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

La capacidad de modificar / visualizar superficies biológicas, y luego estudiar la célula modificada / virión en una serie de in vitro e in vivo en los entornos es esencial para ganar una mayor comprensión de la función de moléculas específicas o toda la entidad. Los estudios de modificación de la superficie biológica se limitan generalmente a la ingeniería genética del organismo o la unión covalente de grupos químicos a los 1,2 de la superficie celular. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de exponer las células a los reactivos químicos, o que requieren la manipulación importantes para lograr el resultado deseado, por lo que engorroso, y también pueden inadvertidamente afectar la viabilidad / funcionalidad de la célula modificada. Un método simple de modificar sin causar daño de la superficie de las células es necesaria. Recientemente una nueva tecnología, tecnología KODE ha introducido una serie de nuevas construcciones que consta de tres componentes: un grupo de cabeza funcionales (F), un espaciador (S) y una cola de lípidos (L) y que se conoce como función-espaciador-lípidos o FSL constructs3. El separador (S) es seleccionada para proporcionar una estructura que se dispersa en el agua, sin embargo, se espontáneamente y de forma estable incorporar en una membrana. FSL construir mitades funcionales (F) hasta ahora incluyen una gama de sacáridos incluyendo los grupos sanguíneos con factores determinantes relacionados, ácido siálico, los polisacáridos de ácido hialurónico, fluoróforos, biotina, radioactivas, y una serie de péptidos 3-12. Construye FSL se han utilizado en la modificación de los embriones, espermatozoides, el pez cebra, las células epiteliales / endometrial, las células rojas de la sangre, y los viriones para crear controles de calidad y sistemas de paneles de diagnóstico, para modificar la adhesión celular / interacción / separación / inmovilización, y para in vitro e in imágenes in vivo de células / viriones 12.03. El proceso de modificación de las células / viriones es genérico y extremadamente simple. El procedimiento más común es la incubación de las células (lípidos en medios de comunicación libres) con una solución de FSL construye durante 1-2 horas a 37 ° C 4.10. Durante la incubación de la FSL construye espontáneamente incorporar en la membrana, y se completa el proceso. El lavado es opcional. Células modificadas por las construcciones que se conoce como FSL kodecytes 6-9, mientras que los viriones son kodevirions 10. FSL construye como infusiones directas y kodecytes / kodevirions se han utilizado en modelos animales experimentales 7,8,10. Todos los kodecytes / kodevirions parecen conservar su vitalidad normal y funcionalidad a la vez ganando la nueva función de la fracción F 7,8,10,11. La combinación de la dispersión en los medios de comunicación biocompatible, la incorporación espontánea en las membranas celulares, y baja toxicidad aparente, hace FSL construcciones valiosas herramientas de investigación para el estudio de las células y los viriones.

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FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Función de los lípidos-Spacer (FSL) construye permiten las características superficiales de las células vivas y los viriones que ser modificado sin la pérdida de vitalidad. El método requiere un contacto sólo una solución simple de construir una célula con FSL / virión y la incorporación de la superficie se produce espontánea y estable.

FSL Construye: Un método simple para la modificación de células / virión superficies con una serie de marcadores biológicos sin afectar su viabilidad

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.7K vistas.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Función de los lípidos-Spacer (FSL) construye permiten las características superficiales de las células vivas y los viriones que ser modificado sin la pérdida de vitalidad. El método requiere un contacto sólo una solución simple de construir una célula con FSL / virión y la incorporación de la superficie se produce espontánea y estable.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Investigación

Biología

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Una lectina Método HPLC para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocolo simple para la extracción de hemocitos de orugas silvestres

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombinería homólogos Construcciones recombinación en<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Un método para la microinyección de<em&gt; Patiria minata</em&gt; Los cigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.