Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia IOS 0844948 y 1024811 IOS

Mantenga toda el agua de mar o agua de mar artificial (SW), los animales adultos, y culturas a 15 ° C, tanto como sea práctico. Asegurarse de huevos y cigotos se mantienen sumergidos en SW. Sales marinas comercialmente preparados reconstituidos con agua destilada o de ósmosis sirve también como fuente de SW. Compruebe la salinidad utilizando un hidrómetro y ajustar sales o agua para lograr niveles óptimos. Mantenga los niveles de gravedad específica entre 1,020-1,025. Guarde todos los objetos de vidrio y plástico separada de todas las demás material de laboratorio para evitar cualquier contaminación con productos químicos. Clean embrión grado material de laboratorio de un enjuague con agua desionizada o de remojo ocasional en hipoclorito de sodio diluido seguido de aclarado varias veces en agua. 1. Obtención y maduración de los gametos patiria miniata Adultos <ol><li> Seleccione un animal para extirpar las gónadas. Determinar el sexo después de la escisión mediante la búsqueda de la presencia de ovarios o los testículos porque P. miniata no son en síxually dimórfico. </li><li> Corte una abertura pequeña, de no más de 1 cm, a lo largo del lado de un brazo de la estrella de mar con una hoja de bisturí (Figura 1A). El uso de pequeñas pinzas de punta roma pull back bordes de la incisión para acceder al tejido gonadal y tire del tejido gonadal a cabo a través de la incisión. NOTA: Evite sacar tejido intestinal, que es un tejido de color gris o marrón suelto (Figura 1B). Los ovarios son generalmente de color naranja, amarillo o marrón claro (Figura 1C), mientras que los testículos son de color blanco o amarillento y cuando interrumpen hará que el agua de mar para convertirse lechosa o turbia en apariencia (Figura 1D). </li><li> Hembras regresan a los acuarios. Aislar hombres por una o dos horas en un recipiente de SW ya que el estrés de la manipulación puede inducir el desove. Animales curan a lo largo de la zona de la incisión y continúan proporcionando gametos durante varios meses. </li><li> Recoger los testículos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con tan poco como sea posible y SW almacenar en hielo hasta su uso. Almacenar cualquier testículos no nosed en el día de la recolección a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Recoge los ovarios en una pequeña placa de cultivo de vidrio en un varios mililitros de SW. Para liberar los ovocitos a partir del tejido de ovario, desmenuzar el tejido con dos pares de pinzas hasta que no quedan trozos grandes. NOTA: En condiciones óptimas, la mayoría de los oocitos están completamente desarrollados. Tales ovocitos son grandes, redondo, y clara amarilla o marrón claro con una vesícula germinal distinta en el ovocito (Figura 2A), en comparación con el subconjunto de ovocitos no desarrollados que son más pequeños, marrón, granulada, y opaco (Figura 2B). Si es mayor que alrededor de 25% de los ovocitos son de la variedad sin desarrollar, seleccionar una hembra diferente para obtener los ovocitos. </li><li> Vierta los ovocitos y el tejido restante a través de una taza filtro de malla con un tamaño de poro de 200 micras y recoger el flujo a través. Este contendrá todas las variedades de ovocitos, pero eliminar el tejido ovárico. Desalojar restantes ovocitos a partir del tejido capturado por el filtro rociando wITH SW de una botella con atomizador. Filtrar los vasos se hacen usando un tubo cónico de 50 ml (Figura 3A-A &#39;). </li><li> Vierta el flujo a través del paso 1.6 a través de un 100 micras taza del filtro de malla. Deseche pequeños ovocitos en el flujo a través. Grandes ovocitos completamente desarrollados que están listos para la maduración se quedará en el filtro. Enjuague los ovocitos en un limpio vaso de 200 ml. </li><li> Añadir 95 ml de SW al vaso de precipitados de vidrio de 200 ml de ovocitos. Añadir 5 ml de 200 mM 1-metiladenina para una concentración final de 10 mM. </li><li> La transferencia de los ovocitos a una gran placa de cultivo superficial y lugar a los 15 ° C. Un área de superficie alta a volumen placa de cultivo permite el intercambio de oxígeno. Los ovocitos no maduran o no se desarrollan bien si son de hacinamiento durante esta fase de maduración. Dividir en varios platos de SW más 10 M 1-methlyadenine hasta que la cultura es menos de 200 ovocitos / ml. </li><li> Permita que los ovocitos que maduran por 45-90 min, pero ya no como este hará que los ovocitos no pueden ser fertilized. Para determinar si la maduración se ha completado, mirar los ovocitos bajo un microscopio de disección. Las vesículas germinales se mueve hacia y se fusiona con la membrana celular durante la maduración. A continuación, se rompe y por lo tanto ya no es visible en ovocitos maduros (Figura 2 C). </li></ol> 2. fecundación de ovocitos maduros <ol><li> Eligió un pequeño grupo de tejido testicular, más o menos del tamaño de un guisante, y carne picada en una pequeña placa de cultivo de vidrio con aproximadamente 1 ml de SW. </li><li> Utilice una pipeta Pasteur transferir 2-3 gotas de agua de mar lechosa resultante de alrededor de 100 ml de los ovocitos maduros y haga girar la placa de cultivo para mezclar. Evitar la transferencia de piezas de tejido testicular. Evite agregar mayores cantidades de esperma, ya que esto puede resultar en poliespermia y pobre desarrollo posterior. </li><li> Después de varios minutos observar los oocitos bajo un microscopio de disección. Los huevos fertilizados o cigotos, tienen un sobre fertilización, que es una esfera transparente que se alza frente a la cell membrana (Figura 2D). NOTA: No proceda con la cultura si es menor de alrededor del 90% de los huevos fertilizar ya que las tasas de fertilización pobres son un indicio de una cultura poco saludable que también no puede desarrollarse bien. </li><li> Después de la fecundación es completa, cambiar el SO en los cigotos vertiendo a través de un filtro de malla de 100 micras y aclarado en una placa de cultivo con SW fresco. Es importante para eliminar el exceso de esperma para evitar la falta de oxígeno. Coloque la placa de cultivo a 15 ° C durante 15-30 min. </li></ol> 3.-De gelificante y Remo huevos fertilizados <ol><li> Preparar platos de inyección mediante la adopción de la tapa de un 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri. <ol><li> Dibuja una línea rotulador permanente en la parte posterior del plato, alrededor de la zona que coincide con el campo de visión en el microscopio microinyección. Esto asegura que todos los embriones rowed están dentro del campo microscópico de vista. </li><li> Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para anotar una línea a través del círculo, preferably a un lado del círculo (Figura 3B). Use esta línea después de romper agujas de inyección (Paso 4.5). NOTA: Los reactivos comúnmente utilizados para adherir embriones de erizo de mar, por ejemplo, sulfato de protamina o poli-L-lisina, son innecesarias. De-gelatina P. cigotos miniata se adhieren muy bien al plástico sin recubrir. Tenga en cuenta que no se adhieren bien a los platos de cristal. </li></ol></li><li> Añadir alrededor de 10 ml SW a cada placa de modo que la superficie está cubierta, pero el agua no salpicará excesivamente en el plato como esto puede perturbar embriones hileras más. </li><li> Retire el P. abrigo miniata jalea cigoto con SW ácido antes de remo. Esta capa de jalea es más extensa que la observada para las especies de erizos de mar modelo. <ol><li> Preparar SW ácido en el intervalo de pH 4,0-4,2. El pH es crítico para permitir la eliminación eficaz de la capa de la jalea al tiempo que permite el desarrollo normal. </li><li> Añadir gotas individuales de 1 N (1 M) HCl en SW a un 1 L de stock de SW. Permita que cada gota se mezcle completamentey controlar el pH antes de la adición de más HCl. NOTA: una a varias ml de HCl resultados en el pH apropiado, pero no añadir todo el volumen a la vez. NOTA: Prepare HCl 1 N en la campana de humos con SW y (M 12) HCl 12 N. </li><li> Retire SW en cigotos vertiéndolos sobre un filtro de malla de 100 micras. Enjuague en un vaso de 200 ml en la menor cantidad de SW posible (aproximadamente 10 ml). Llene el vaso de precipitados hasta 150 ml con SW ácido (pH 4.0) y permitir que los cigotos para sentarse en el SW ácido durante 3 min. </li></ol></li><li> Pelar capa de jalea de los cigotos mediante el vertido de un lado a otro entre dos vasos de precipitados de 200 ml, cada vez que pasa los cigotos a través de un filtro de malla de 200 micras. Vierta los cigotos a través del filtro alrededor 5-10x durante aproximadamente una ventana de tiempo de 2 min. </li><li> Retire SW ácido vertiendo los cigotos a un filtro de malla de 100 micras. Enjuague los cigotos en una pequeña placa de cultivo de vidrio con SW. Cigotos en gelatina-De pueden pegarse a los platos de plástico. Embriones fila inmediatamente; comienzan a producir más jelly capa que conduce a una mala adherencia a placas de plástico con el tiempo. </li><li> Utilice una pipeta de boca (Figura 3 C-C &#39;) para recoger a los cigotos de la placa de cultivo de vidrio y colocarlos en líneas rectas en los platos de inyección. Fundir el centro de la parte delgada de una pipeta Pasteur sobre una llama hasta que el vidrio es suave. Tirar rápidamente los extremos del vidrio aparte para producir un tramo muy delgada de vidrio. Una vez que el vaso esté frío, rompa el pequeño extremo de la pipeta Pasteur (para obtener información adicional sobre la preparación de una pipeta de boca ver Wessel et al. 2004 17 o Sweet et al. 2004 18). <ol><li> Hacer una pipeta de remo tal que el diámetro es sólo mayor que el diámetro de los embriones de modo que sólo un único cigoto entrar y salir de la pipeta a la vez. Esto permitirá una sola fila a la forma. Pipetas de menor diámetro pueden despojar el sobre fertilización y perturbar los cigotos como P. cigotos miniata no tienen una membrana hialina unand son bastante suaves. </li><li> Si los cigotos no se adhieren a la placa de plástico, mantenerlos por el tiempo adicional en SW ácido (hasta varios minutos). Alternativamente una pipeta de diámetro más pequeño puede ayudar en la eliminación de la capa de la jalea para permitir que los cigotos se peguen más eficaz. </li><li> Los cigotos son un poco flotabilidad positiva y tienden a flotar o flotar justo por encima de la parte inferior del plato. En este caso, la posición de la pipeta de remo de modo que los cigotos se presionan suavemente sobre la superficie de la placa cuando se aproximan a la pipeta (Figura 3D). NOTA:. Está permitido encajar muchas filas en estos platos P. membranas embrionarias miniata no se vuelven más difíciles de penetrar en el tiempo y, por tanto, uno puede inyectar cientos de cigotos en un solo plato. </li></ol></li></ol> 4. inyección de cigotos <ol><li> Preparar soluciones de inyección con concentraciones apropiadas de oligonucleótidos antisentido morfolino (MASO), ARNm, o ADN en una concentración finalentration de 200 mM KCl. 400-800 M MASO y 2,5 ng / l de ADN tienden a producir fenotipos morphant mientras que se minimiza la toxicidad. La concentración final en el huevo será 1/125 ª de la concentración de partida 14. Para soluciones inyectables que contienen masos, calentar a 65 ° C durante 5 minutos inmediatamente antes de su uso y luego almacenar a temperatura ambiente. <ol><li> Para facilitar la clasificación de los embriones inyectados, añadir rodamina dextrano trazador a la solución de inyección para obtener una concentración de 0,1%. </li></ol></li><li> Preparar agujas de inyección tirando de tubo capilar de vidrio (1,0 mm OD x 0,75 mm ID, 100 mm de longitud) en una aguja de tracción instrumento siguiendo las instrucciones del fabricante. Las agujas adecuadas para la inyección en los erizos de mar también funcionan bien para las estrellas de mar, por lo que utilizan parámetros similares 19. </li><li> Cargue aproximadamente 2 l de solución de inyección en una aguja de inyección usando una punta de pipeta microloader. </li><li> Insertar el extremo romo de la aguja en el manipulator. Establecer Picospritzer a 100 pulsos ms y una presión de aire de 40 PSI. </li><li> Coloque un plato de embriones remado en la platina del microscopio y tienen todos los embriones en el campo de visión. Orientar el plato de tal manera que la línea de marcado está en el lado más cercano a la aguja. Coloque la aguja en un ángulo de aproximadamente 60 ° para que la punta se encuentra cerca del centro de la línea y justo por encima de la superficie del agua. </li><li> Se centran en la línea marcada y bajar la aguja hasta que la punta quede enfocada. Baje la punta un poco más y lo rompiera abierto ejecutando suavemente en las crestas de la línea marcada. Con la punta de la superficie del plato y colocarlo en la parte superior de la primera fila de cigotos y centrarse en los cigotos. </li><li> Bajar la punta tal que atravesar el centro de cigoto que viene de alrededor de un ángulo de 60 °. La aguja penetra fácilmente P. cigotos miniata. Pisar el pedal de pie (u otros medios de forzar el material de la aguja de inyección) para introducir un bolo de injesolución cción en el embrión. </li><li> Objetivo de un bolo que es de 20-30% del diámetro del embrión, o entre 25 y 80 pl. Si el bolo es mayor o menor que esto, ajustar la duración de la inyección en el Picospritzer e inyectar la próxima embrión. Siga ajustando la duración para obtener el tamaño del bolo deseado. Comience en 100 ms de duración. Re-rompa la aguja si es mayor de alrededor de 200 ms se necesita introducir el bolo apropiado. Deseche la aguja y preparar una nueva si se necesita menos de 15 a 20 ms para obtener este tamaño bolo como el tamaño de la aguja es demasiado grande y puede interrumpir el desarrollo normal. </li><li> Proceda para inyectar los cigotos restantes en el plato de inyección. Los embriones fácilmente se puede inyectar hasta que comience la escisión y en blastómeros independientes, después de la primera escisión. Periódicamente levantar la aguja por encima de la superficie del agua para eliminar los cigotos que se pegan sobre la aguja. Si es necesario volver a romper la punta de la aguja o cargar una nueva aguja si se produce un bloqueo. </li></ol><ol><li> Permita que los embriones que se desarrollan a 15 ° C en el suroeste. Mantener el área de superficie de alto volumen en las culturas para permitir el intercambio de oxígeno. Asegúrese de embriones no están llenas de gente; mantener las culturas en o por debajo de los 200 embriones / ml. Dependiendo de la etapa deseada del embrión, el plan para recoger embriones inyectados en alrededor de 20 a 24 horas después de la fertilización. NOTA: Esto es a menudo un momento ideal para ordenar y recoger y debido a los embriones en desarrollo normalmente se distinguen fácilmente morfológicamente, pero que aún no están nadando. </li><li> Si los embriones han eclosionado, sal con cuidado de choque para evitar la natación. Añadir 200 l de NaCl 5 M a 10 ml de SW en el plato de inyección mientras se agita suavemente el SW. Después de unos minutos, los embriones caerán a la parte inferior del plato. Reunir estos y moverlos a la normalidad SW salinidad. </li><li> Recoger los embriones inyectados bajo una fuente de luz fluorescente apropiada compatible con el trazador utilizado en el injectien solución. Si no se utilizó ningún marcador, clasificar los embriones para seleccionar para la morfología normal. </li><li> Con una pipeta de boca, dibujar fluorescente embriones con una cantidad mínima de SW y soplar hacia fuera en una pequeña placa de cultivo lleno de SW. Pipetas de boca ideales tienen una gran abertura suficiente para que los embriones que se sacaron y salir sin dañarlos, pero no tan grande que los embriones no deseados y SW ajeno también se detuvieron. </li><li> Una vez que todos los embriones deseados se han recogido en el nuevo plato, observar los embriones bajo luz fluorescente y eliminar cualquier embrión un-inyectado embriones o poco desarrollados. </li><li> Cultura ordenadas embriones a etapas deseadas en una incubadora y proceder con imágenes u otros protocolos deseados. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado por los autores.

Hay dos pasos críticos que son difíciles para los usuarios novatos de esta técnica, pero son esenciales para la creación de embriones con éxito morphant. La primera es la selección de los ovocitos sanos que madurarán y fertilizar adecuadamente. El porcentaje de desarrollo normal en una cultura depende de la temporada, la salud del animal, y el número de veces que los ovocitos han sido recolectadas de un solo individuo. Los ovocitos suelen ser de mejor calidad a partir de abril a octubre. Es importante examinar c...

La estrella de mar, patiria miniata, (comúnmente conocido como el palo de la estrella) se perfila como una interesante y versátil sistema de modelo para una variedad de celulares del 1 al 3, de desarrollo de 4,5, evolutiva 6 8, y estudios ecológicos 9- 11. Adultos P. miniata se distribuyen a lo largo de la costa pacífica de Sitka, Alaska a Baja, California 12 y se mantienen fácilmente en acuarios marinos. Los ovocitos son durante todo el año se puede obtener y cada hembra puede arrojar decenas de miles de huevos. Los ovocitos son fácilmente madurados y fecundados externamente 13. Los embriones resultantes son transparentes lo que permite la observación fácil; se desarrollan de forma sincrónica, y requieren sólo agua de mar para el desarrollo. Montaje del genoma entero y varios transcriptomes también están disponibles para P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Estas ventajas hacen que sean ideales para una amplia gama de investigacióny con fines didácticos. En los últimos años, P. miniata se ha convertido en un sistema modelo para la red de regulación de genes del desarrollo analiza 14 al 16. El objetivo de estos estudios es identificar todo el complemento de genes reguladores y determinar la red de sus interacciones. Mucho de este trabajo implica perturbadora expresión génica mediante la introducción de oligonucleótidos antisentido o en mRNAs in vitro sintetizado. Además, los análisis reguladores cis se utilizan para caracterizar la función del ADN reguladora 15. Estos análisis requieren introducción de reactivos de perturbación y / o reportero de constructos de ADN en embriones. Además, para caracterizar los efectos aguas abajo de estas perturbaciones, se debe ensayar muchos embriones por cambios en la expresión génica de objetivos potenciales. Técnicas para la microinyección de muchos cientos de cigotos son centrales para este trabajo. Equinodermos, incluyendo P. miniata </em&gt;, requieren muchos meses para alcanzar la madurez sexual. Debido a esto, generalmente no es práctico para desarrollar y mantener las líneas transgénicas de estos animales para la experimentación. Por lo tanto, la cría de los adultos transgénicos no puede de manera eficiente crear embriones modificado. En cambio, la perturbación debe ocurrir de novo a través de microinyección. Microinyección ofrece la oportunidad de modificar los embriones con reactivos que no son de células permeables. El siguiente protocolo describe un método para introducir ADN, ARNm, trazadores de células, y oligonucleótidos antisentido morfolino en cientos de huevos fertilizados en un 2-3 hr sesión a través de microinyección. Esto produce material suficiente para una variedad de experimentos posteriores, incluyendo, pero no limitado a, qPCR, hibridación in situ, ARN-Seq, y el Western Blot.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Los equinodermos han sido durante mucho tiempo un sistema modelo preferido para los estudios de reproducción y el desarrollo, y más recientemente para el estudio de la regulación de genes y la evolución de los procesos de desarrollo. La estrella de mar, patiria miniata, está ganando prevalencia como un sistema modelo para este tipo de estudios que antes se realizaban casi exclusivamente en los erizos de mar, Strongylocentrotus purpuratus y Lytechinus variegatus. Una ventaja de estos sistemas de modelo es la facilidad de producir embriones modificados en los que un gen particular es hacia arriba o downregulated, el etiquetado de un grupo de células, o la introducción de un gen informador. Un único método de microinyección es capaz de crear una amplia variedad de tales embriones modificados. A continuación, presentamos un método para la obtención de gametos a partir de P. miniata, producir cigotos, y la introducción de reactivos perturbadores mediante microinyección. Posteriormente morphant embriones sanos son aislados para estudios cuantitativos y cualitativos de la gefunción ne. La disponibilidad de datos sobre el genoma y transcriptoma para este organismo ha aumentado los tipos de estudios que se realizan y la facilidad de ejecución de ellos.

El objetivo de este protocolo es introducir los reactivos en los embriones. Se demuestra la eficacia del protocolo mediante la inyección de un constructo reportero de ADN que conduce la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). Inyectado embriones expresan GFP en parches clonales (Figura 4A-B) como incorpora el ADN durante la escisión temprana. Muchos reactivos que son deseables para introducir en los embriones son tóxicos en cantidades elevadas y para lotes subóptimas de embriones. Manif...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de<em&gt; Patiria minata</em&gt; Los cigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K vistas.  Carnegie Mellon University.  Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie. 

Video: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Investigación

Biología

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...