Name: a method for microinjection of patiria minata zygotes
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia IOS 0844948 y 1024811 IOS

Mantenga toda el agua de mar o agua de mar artificial (SW), los animales adultos, y culturas a 15 ° C, tanto como sea práctico. Asegurarse de huevos y cigotos se mantienen sumergidos en SW. Sales marinas comercialmente preparados reconstituidos con agua destilada o de ósmosis sirve también como fuente de SW. Compruebe la salinidad utilizando un hidrómetro y ajustar sales o agua para lograr niveles óptimos. Mantenga los niveles de gravedad específica entre 1,020-1,025. Guarde todos los objetos de vidrio y plástico separada de todas las demás material de laboratorio para evitar cualquier contaminación con productos químicos. Clean embrión grado material de laboratorio de un enjuague con agua desionizada o de remojo ocasional en hipoclorito de sodio diluido seguido de aclarado varias veces en agua. 1. Obtención y maduración de los gametos patiria miniata Adultos <ol><li> Seleccione un animal para extirpar las gónadas. Determinar el sexo después de la escisión mediante la búsqueda de la presencia de ovarios o los testículos porque P. miniata no son en síxually dimórfico. </li><li> Corte una abertura pequeña, de no más de 1 cm, a lo largo del lado de un brazo de la estrella de mar con una hoja de bisturí (Figura 1A). El uso de pequeñas pinzas de punta roma pull back bordes de la incisión para acceder al tejido gonadal y tire del tejido gonadal a cabo a través de la incisión. NOTA: Evite sacar tejido intestinal, que es un tejido de color gris o marrón suelto (Figura 1B). Los ovarios son generalmente de color naranja, amarillo o marrón claro (Figura 1C), mientras que los testículos son de color blanco o amarillento y cuando interrumpen hará que el agua de mar para convertirse lechosa o turbia en apariencia (Figura 1D). </li><li> Hembras regresan a los acuarios. Aislar hombres por una o dos horas en un recipiente de SW ya que el estrés de la manipulación puede inducir el desove. Animales curan a lo largo de la zona de la incisión y continúan proporcionando gametos durante varios meses. </li><li> Recoger los testículos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con tan poco como sea posible y SW almacenar en hielo hasta su uso. Almacenar cualquier testículos no nosed en el día de la recolección a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Recoge los ovarios en una pequeña placa de cultivo de vidrio en un varios mililitros de SW. Para liberar los ovocitos a partir del tejido de ovario, desmenuzar el tejido con dos pares de pinzas hasta que no quedan trozos grandes. NOTA: En condiciones óptimas, la mayoría de los oocitos están completamente desarrollados. Tales ovocitos son grandes, redondo, y clara amarilla o marrón claro con una vesícula germinal distinta en el ovocito (Figura 2A), en comparación con el subconjunto de ovocitos no desarrollados que son más pequeños, marrón, granulada, y opaco (Figura 2B). Si es mayor que alrededor de 25% de los ovocitos son de la variedad sin desarrollar, seleccionar una hembra diferente para obtener los ovocitos. </li><li> Vierta los ovocitos y el tejido restante a través de una taza filtro de malla con un tamaño de poro de 200 micras y recoger el flujo a través. Este contendrá todas las variedades de ovocitos, pero eliminar el tejido ovárico. Desalojar restantes ovocitos a partir del tejido capturado por el filtro rociando wITH SW de una botella con atomizador. Filtrar los vasos se hacen usando un tubo cónico de 50 ml (Figura 3A-A &#39;). </li><li> Vierta el flujo a través del paso 1.6 a través de un 100 micras taza del filtro de malla. Deseche pequeños ovocitos en el flujo a través. Grandes ovocitos completamente desarrollados que están listos para la maduración se quedará en el filtro. Enjuague los ovocitos en un limpio vaso de 200 ml. </li><li> Añadir 95 ml de SW al vaso de precipitados de vidrio de 200 ml de ovocitos. Añadir 5 ml de 200 mM 1-metiladenina para una concentración final de 10 mM. </li><li> La transferencia de los ovocitos a una gran placa de cultivo superficial y lugar a los 15 ° C. Un área de superficie alta a volumen placa de cultivo permite el intercambio de oxígeno. Los ovocitos no maduran o no se desarrollan bien si son de hacinamiento durante esta fase de maduración. Dividir en varios platos de SW más 10 M 1-methlyadenine hasta que la cultura es menos de 200 ovocitos / ml. </li><li> Permita que los ovocitos que maduran por 45-90 min, pero ya no como este hará que los ovocitos no pueden ser fertilized. Para determinar si la maduración se ha completado, mirar los ovocitos bajo un microscopio de disección. Las vesículas germinales se mueve hacia y se fusiona con la membrana celular durante la maduración. A continuación, se rompe y por lo tanto ya no es visible en ovocitos maduros (Figura 2 C). </li></ol> 2. fecundación de ovocitos maduros <ol><li> Eligió un pequeño grupo de tejido testicular, más o menos del tamaño de un guisante, y carne picada en una pequeña placa de cultivo de vidrio con aproximadamente 1 ml de SW. </li><li> Utilice una pipeta Pasteur transferir 2-3 gotas de agua de mar lechosa resultante de alrededor de 100 ml de los ovocitos maduros y haga girar la placa de cultivo para mezclar. Evitar la transferencia de piezas de tejido testicular. Evite agregar mayores cantidades de esperma, ya que esto puede resultar en poliespermia y pobre desarrollo posterior. </li><li> Después de varios minutos observar los oocitos bajo un microscopio de disección. Los huevos fertilizados o cigotos, tienen un sobre fertilización, que es una esfera transparente que se alza frente a la cell membrana (Figura 2D). NOTA: No proceda con la cultura si es menor de alrededor del 90% de los huevos fertilizar ya que las tasas de fertilización pobres son un indicio de una cultura poco saludable que también no puede desarrollarse bien. </li><li> Después de la fecundación es completa, cambiar el SO en los cigotos vertiendo a través de un filtro de malla de 100 micras y aclarado en una placa de cultivo con SW fresco. Es importante para eliminar el exceso de esperma para evitar la falta de oxígeno. Coloque la placa de cultivo a 15 ° C durante 15-30 min. </li></ol> 3.-De gelificante y Remo huevos fertilizados <ol><li> Preparar platos de inyección mediante la adopción de la tapa de un 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri. <ol><li> Dibuja una línea rotulador permanente en la parte posterior del plato, alrededor de la zona que coincide con el campo de visión en el microscopio microinyección. Esto asegura que todos los embriones rowed están dentro del campo microscópico de vista. </li><li> Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para anotar una línea a través del círculo, preferably a un lado del círculo (Figura 3B). Use esta línea después de romper agujas de inyección (Paso 4.5). NOTA: Los reactivos comúnmente utilizados para adherir embriones de erizo de mar, por ejemplo, sulfato de protamina o poli-L-lisina, son innecesarias. De-gelatina P. cigotos miniata se adhieren muy bien al plástico sin recubrir. Tenga en cuenta que no se adhieren bien a los platos de cristal. </li></ol></li><li> Añadir alrededor de 10 ml SW a cada placa de modo que la superficie está cubierta, pero el agua no salpicará excesivamente en el plato como esto puede perturbar embriones hileras más. </li><li> Retire el P. abrigo miniata jalea cigoto con SW ácido antes de remo. Esta capa de jalea es más extensa que la observada para las especies de erizos de mar modelo. <ol><li> Preparar SW ácido en el intervalo de pH 4,0-4,2. El pH es crítico para permitir la eliminación eficaz de la capa de la jalea al tiempo que permite el desarrollo normal. </li><li> Añadir gotas individuales de 1 N (1 M) HCl en SW a un 1 L de stock de SW. Permita que cada gota se mezcle completamentey controlar el pH antes de la adición de más HCl. NOTA: una a varias ml de HCl resultados en el pH apropiado, pero no añadir todo el volumen a la vez. NOTA: Prepare HCl 1 N en la campana de humos con SW y (M 12) HCl 12 N. </li><li> Retire SW en cigotos vertiéndolos sobre un filtro de malla de 100 micras. Enjuague en un vaso de 200 ml en la menor cantidad de SW posible (aproximadamente 10 ml). Llene el vaso de precipitados hasta 150 ml con SW ácido (pH 4.0) y permitir que los cigotos para sentarse en el SW ácido durante 3 min. </li></ol></li><li> Pelar capa de jalea de los cigotos mediante el vertido de un lado a otro entre dos vasos de precipitados de 200 ml, cada vez que pasa los cigotos a través de un filtro de malla de 200 micras. Vierta los cigotos a través del filtro alrededor 5-10x durante aproximadamente una ventana de tiempo de 2 min. </li><li> Retire SW ácido vertiendo los cigotos a un filtro de malla de 100 micras. Enjuague los cigotos en una pequeña placa de cultivo de vidrio con SW. Cigotos en gelatina-De pueden pegarse a los platos de plástico. Embriones fila inmediatamente; comienzan a producir más jelly capa que conduce a una mala adherencia a placas de plástico con el tiempo. </li><li> Utilice una pipeta de boca (Figura 3 C-C &#39;) para recoger a los cigotos de la placa de cultivo de vidrio y colocarlos en líneas rectas en los platos de inyección. Fundir el centro de la parte delgada de una pipeta Pasteur sobre una llama hasta que el vidrio es suave. Tirar rápidamente los extremos del vidrio aparte para producir un tramo muy delgada de vidrio. Una vez que el vaso esté frío, rompa el pequeño extremo de la pipeta Pasteur (para obtener información adicional sobre la preparación de una pipeta de boca ver Wessel et al. 2004 17 o Sweet et al. 2004 18). <ol><li> Hacer una pipeta de remo tal que el diámetro es sólo mayor que el diámetro de los embriones de modo que sólo un único cigoto entrar y salir de la pipeta a la vez. Esto permitirá una sola fila a la forma. Pipetas de menor diámetro pueden despojar el sobre fertilización y perturbar los cigotos como P. cigotos miniata no tienen una membrana hialina unand son bastante suaves. </li><li> Si los cigotos no se adhieren a la placa de plástico, mantenerlos por el tiempo adicional en SW ácido (hasta varios minutos). Alternativamente una pipeta de diámetro más pequeño puede ayudar en la eliminación de la capa de la jalea para permitir que los cigotos se peguen más eficaz. </li><li> Los cigotos son un poco flotabilidad positiva y tienden a flotar o flotar justo por encima de la parte inferior del plato. En este caso, la posición de la pipeta de remo de modo que los cigotos se presionan suavemente sobre la superficie de la placa cuando se aproximan a la pipeta (Figura 3D). NOTA:. Está permitido encajar muchas filas en estos platos P. membranas embrionarias miniata no se vuelven más difíciles de penetrar en el tiempo y, por tanto, uno puede inyectar cientos de cigotos en un solo plato. </li></ol></li></ol> 4. inyección de cigotos <ol><li> Preparar soluciones de inyección con concentraciones apropiadas de oligonucleótidos antisentido morfolino (MASO), ARNm, o ADN en una concentración finalentration de 200 mM KCl. 400-800 M MASO y 2,5 ng / l de ADN tienden a producir fenotipos morphant mientras que se minimiza la toxicidad. La concentración final en el huevo será 1/125 ª de la concentración de partida 14. Para soluciones inyectables que contienen masos, calentar a 65 ° C durante 5 minutos inmediatamente antes de su uso y luego almacenar a temperatura ambiente. <ol><li> Para facilitar la clasificación de los embriones inyectados, añadir rodamina dextrano trazador a la solución de inyección para obtener una concentración de 0,1%. </li></ol></li><li> Preparar agujas de inyección tirando de tubo capilar de vidrio (1,0 mm OD x 0,75 mm ID, 100 mm de longitud) en una aguja de tracción instrumento siguiendo las instrucciones del fabricante. Las agujas adecuadas para la inyección en los erizos de mar también funcionan bien para las estrellas de mar, por lo que utilizan parámetros similares 19. </li><li> Cargue aproximadamente 2 l de solución de inyección en una aguja de inyección usando una punta de pipeta microloader. </li><li> Insertar el extremo romo de la aguja en el manipulator. Establecer Picospritzer a 100 pulsos ms y una presión de aire de 40 PSI. </li><li> Coloque un plato de embriones remado en la platina del microscopio y tienen todos los embriones en el campo de visión. Orientar el plato de tal manera que la línea de marcado está en el lado más cercano a la aguja. Coloque la aguja en un ángulo de aproximadamente 60 ° para que la punta se encuentra cerca del centro de la línea y justo por encima de la superficie del agua. </li><li> Se centran en la línea marcada y bajar la aguja hasta que la punta quede enfocada. Baje la punta un poco más y lo rompiera abierto ejecutando suavemente en las crestas de la línea marcada. Con la punta de la superficie del plato y colocarlo en la parte superior de la primera fila de cigotos y centrarse en los cigotos. </li><li> Bajar la punta tal que atravesar el centro de cigoto que viene de alrededor de un ángulo de 60 °. La aguja penetra fácilmente P. cigotos miniata. Pisar el pedal de pie (u otros medios de forzar el material de la aguja de inyección) para introducir un bolo de injesolución cción en el embrión. </li><li> Objetivo de un bolo que es de 20-30% del diámetro del embrión, o entre 25 y 80 pl. Si el bolo es mayor o menor que esto, ajustar la duración de la inyección en el Picospritzer e inyectar la próxima embrión. Siga ajustando la duración para obtener el tamaño del bolo deseado. Comience en 100 ms de duración. Re-rompa la aguja si es mayor de alrededor de 200 ms se necesita introducir el bolo apropiado. Deseche la aguja y preparar una nueva si se necesita menos de 15 a 20 ms para obtener este tamaño bolo como el tamaño de la aguja es demasiado grande y puede interrumpir el desarrollo normal. </li><li> Proceda para inyectar los cigotos restantes en el plato de inyección. Los embriones fácilmente se puede inyectar hasta que comience la escisión y en blastómeros independientes, después de la primera escisión. Periódicamente levantar la aguja por encima de la superficie del agua para eliminar los cigotos que se pegan sobre la aguja. Si es necesario volver a romper la punta de la aguja o cargar una nueva aguja si se produce un bloqueo. </li></ol><ol><li> Permita que los embriones que se desarrollan a 15 ° C en el suroeste. Mantener el área de superficie de alto volumen en las culturas para permitir el intercambio de oxígeno. Asegúrese de embriones no están llenas de gente; mantener las culturas en o por debajo de los 200 embriones / ml. Dependiendo de la etapa deseada del embrión, el plan para recoger embriones inyectados en alrededor de 20 a 24 horas después de la fertilización. NOTA: Esto es a menudo un momento ideal para ordenar y recoger y debido a los embriones en desarrollo normalmente se distinguen fácilmente morfológicamente, pero que aún no están nadando. </li><li> Si los embriones han eclosionado, sal con cuidado de choque para evitar la natación. Añadir 200 l de NaCl 5 M a 10 ml de SW en el plato de inyección mientras se agita suavemente el SW. Después de unos minutos, los embriones caerán a la parte inferior del plato. Reunir estos y moverlos a la normalidad SW salinidad. </li><li> Recoger los embriones inyectados bajo una fuente de luz fluorescente apropiada compatible con el trazador utilizado en el injectien solución. Si no se utilizó ningún marcador, clasificar los embriones para seleccionar para la morfología normal. </li><li> Con una pipeta de boca, dibujar fluorescente embriones con una cantidad mínima de SW y soplar hacia fuera en una pequeña placa de cultivo lleno de SW. Pipetas de boca ideales tienen una gran abertura suficiente para que los embriones que se sacaron y salir sin dañarlos, pero no tan grande que los embriones no deseados y SW ajeno también se detuvieron. </li><li> Una vez que todos los embriones deseados se han recogido en el nuevo plato, observar los embriones bajo luz fluorescente y eliminar cualquier embrión un-inyectado embriones o poco desarrollados. </li><li> Cultura ordenadas embriones a etapas deseadas en una incubadora y proceder con imágenes u otros protocolos deseados. </li></ol>

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A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado por los autores.

Hay dos pasos críticos que son difíciles para los usuarios novatos de esta técnica, pero son esenciales para la creación de embriones con éxito morphant. La primera es la selección de los ovocitos sanos que madurarán y fertilizar adecuadamente. El porcentaje de desarrollo normal en una cultura depende de la temporada, la salud del animal, y el número de veces que los ovocitos han sido recolectadas de un solo individuo. Los ovocitos suelen ser de mejor calidad a partir de abril a octubre. Es importante examinar cuidadosamente los ovocitos antes de proceder a asegurar que la mayoría ve como la figura 2A en lugar de la figura 2B. Es permisible tener un pequeño número de ovocitos que no maduran, sobre todo si son lo suficientemente pequeños para filtrar como se procesan los ovocitos. De vez en cuando, los ovocitos que son sin desarrollar son casi tan grandes como los ovocitos completamente desarrollados que están listos para la maduración. Se distinguen por su grano, colorin marróng (Figura 2E). No utilizar lotes de ovocitos de este tipo, porque la filtración no aislará ovocitos completamente desarrollados a partir de ovocitos sin desarrollar y que a menudo dar lugar a cultivos de embriones anormales que son más propensos a exhibir los defectos observados en la Figura 5. El otro paso crítico es el tamaño del bolo de inyección. Introducir una cantidad de reactivo perturbadora que es lo suficientemente grande como para ejercer un efecto, pero no tan grande como para causar efectos no específicos. La primera vez que se utiliza un reactivo perturbadora, es útil para llevar a cabo una titulación en el que se trataron varias concentraciones de reactivo. Realizar microinyecciones posteriores con la concentración más alta que no causa anomalías en el desarrollo que no están relacionados con el fenotipo esperado, o el desarrollo de retardo (Figura 5A). Evitar la inyección de un bolo que es mayor que 30% el diámetro del embrión ya que esto puede interrumpir el desarrollo normal. Excesivamente pequeños tamaños de bolo, por contrast, son difíciles de inspeccionar visualmente para determinar el tamaño coherente que puede conducir a una excesiva gama de fenotipos de perturbación a través de repeticiones. Reactivos perturbadores pueden causar retrasos en el desarrollo o fenotipos no específicos en rangos de concentración eficaces. Es muy importante, por lo tanto, para inyectar hermano controles con un reactivo benigno como un control estándar MASO, construcciones de ADN estándar, o trazador rodamina. Embriones morphant ensayo sólo si estos controles muestran un desarrollo normal. Embriones inyectados, incluidos los controles, a veces exhiben un fenotipo blástula arrugada pero con frecuencia se procederá por el resto de desarrollo normalmente. Además, si un reactivo particular causa constantemente retrasos en el desarrollo en los embriones resultantes morphant, comparar estos embriones para controlar los embriones para determinar cuántas horas de retraso que están experimentando. Hay algunas características de este método que pueden limitar su utilidad en sescenarios experimentales ESPECÍFICAS. Uno de ellos es el hecho de que sólo se puede introducir reactivos en el óvulo fertilizado o división etapas tempranas. Esto es particularmente problemático si el gen o vía de interés es especialmente crucial en el desarrollo temprano y morphant embriones resultantes son inviables o demasiado desarrollo anormal para estudio significativo. A veces, este problema se resuelve mediante la inyección de un menor número de copias del reactivo perturbadora, dando como resultado una caída más suave incompleta. Si existe un fármaco permeable a las células apropiado para el gen diana o de una vía, es útil para comparar el fenotipo de embriones inyectados con reactivos en la fase de huevo fertilizado con los embriones tratados con el fármaco a una etapa más apropiado después. Debido a la inyección de ARNm o Masos ofrece una mayor especificidad, es más potente para utilizar este método en combinación con un estudio de tratamiento de drogas en comparación con el abandono de microinyección a favor del tratamiento de drogas. Finalmente, aunque este micrométodo de inyección producirá una cantidad suficiente de embriones para una amplia variedad de aplicaciones posteriores, será en el mejor de producir varios cien hasta un mil embriones sanos, inyectados con éxito. Algunos experimentos deseados pueden requerir considerablemente más material del que esta. Otros métodos utilizados con éxito en el sistema de erizo de mar pueden ser modificados para crear un número aún mayor de embriones de estrella de mar morphant, tales como retrovirus pantrópicas 20, aunque este método es nuevo y aún no ha alcanzado un uso generalizado.

La estrella de mar, patiria miniata, (comúnmente conocido como el palo de la estrella) se perfila como una interesante y versátil sistema de modelo para una variedad de celulares del 1 al 3, de desarrollo de 4,5, evolutiva 6 8, y estudios ecológicos 9- 11. Adultos P. miniata se distribuyen a lo largo de la costa pacífica de Sitka, Alaska a Baja, California 12 y se mantienen fácilmente en acuarios marinos. Los ovocitos son durante todo el año se puede obtener y cada hembra puede arrojar decenas de miles de huevos. Los ovocitos son fácilmente madurados y fecundados externamente 13. Los embriones resultantes son transparentes lo que permite la observación fácil; se desarrollan de forma sincrónica, y requieren sólo agua de mar para el desarrollo. Montaje del genoma entero y varios transcriptomes también están disponibles para P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Estas ventajas hacen que sean ideales para una amplia gama de investigacióny con fines didácticos. En los últimos años, P. miniata se ha convertido en un sistema modelo para la red de regulación de genes del desarrollo analiza 14 al 16. El objetivo de estos estudios es identificar todo el complemento de genes reguladores y determinar la red de sus interacciones. Mucho de este trabajo implica perturbadora expresión génica mediante la introducción de oligonucleótidos antisentido o en mRNAs in vitro sintetizado. Además, los análisis reguladores cis se utilizan para caracterizar la función del ADN reguladora 15. Estos análisis requieren introducción de reactivos de perturbación y / o reportero de constructos de ADN en embriones. Además, para caracterizar los efectos aguas abajo de estas perturbaciones, se debe ensayar muchos embriones por cambios en la expresión génica de objetivos potenciales. Técnicas para la microinyección de muchos cientos de cigotos son centrales para este trabajo. Equinodermos, incluyendo P. miniata </em&gt;, requieren muchos meses para alcanzar la madurez sexual. Debido a esto, generalmente no es práctico para desarrollar y mantener las líneas transgénicas de estos animales para la experimentación. Por lo tanto, la cría de los adultos transgénicos no puede de manera eficiente crear embriones modificado. En cambio, la perturbación debe ocurrir de novo a través de microinyección. Microinyección ofrece la oportunidad de modificar los embriones con reactivos que no son de células permeables. El siguiente protocolo describe un método para introducir ADN, ARNm, trazadores de células, y oligonucleótidos antisentido morfolino en cientos de huevos fertilizados en un 2-3 hr sesión a través de microinyección. Esto produce material suficiente para una variedad de experimentos posteriores, incluyendo, pero no limitado a, qPCR, hibridación in situ, ARN-Seq, y el Western Blot.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Los equinodermos han sido durante mucho tiempo un sistema modelo preferido para los estudios de reproducción y el desarrollo, y más recientemente para el estudio de la regulación de genes y la evolución de los procesos de desarrollo. La estrella de mar, patiria miniata, está ganando prevalencia como un sistema modelo para este tipo de estudios que antes se realizaban casi exclusivamente en los erizos de mar, Strongylocentrotus purpuratus y Lytechinus variegatus. Una ventaja de estos sistemas de modelo es la facilidad de producir embriones modificados en los que un gen particular es hacia arriba o downregulated, el etiquetado de un grupo de células, o la introducción de un gen informador. Un único método de microinyección es capaz de crear una amplia variedad de tales embriones modificados. A continuación, presentamos un método para la obtención de gametos a partir de P. miniata, producir cigotos, y la introducción de reactivos perturbadores mediante microinyección. Posteriormente morphant embriones sanos son aislados para estudios cuantitativos y cualitativos de la gefunción ne. La disponibilidad de datos sobre el genoma y transcriptoma para este organismo ha aumentado los tipos de estudios que se realizan y la facilidad de ejecución de ellos.

El objetivo de este protocolo es introducir los reactivos en los embriones. Se demuestra la eficacia del protocolo mediante la inyección de un constructo reportero de ADN que conduce la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). Inyectado embriones expresan GFP en parches clonales (Figura 4A-B) como incorpora el ADN durante la escisión temprana. Muchos reactivos que son deseables para introducir en los embriones son tóxicos en cantidades elevadas y para lotes subóptimas de embriones. Manifiestos de toxicidad por retrasar el desarrollo, deteniendo el desarrollo de clivaje temprano o en la etapa del huevo fertilizado, o mediante la imposición de desarrollo aberrante (Figura 5A-C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Obtención de gametos procedentes de P. adultos miniata. A) Para extirpar gónadas hacen una incisión en el lado proximal de un brazoa la mitad del animal. B) El material de color marrón oscuro sacado de esta incisión es tejido intestinal. Evitar tirando de tejido intestinal, ya que daña al animal. C) tejido de ovario es generalmente de color naranja en el color como se muestra aquí, pero también puede ser de color amarillo o marrón claro. Testículos D) son de color blanco o de color beige, como se muestra. Todas las barras de escala denotan 1 cm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. maduración y fertilización de oocitos. A) ovocitos sanos que están listos para la maduración son grandes y claro con una vesícula germinal visible. B) Los ovocitos que no están listos para la maduración son más pequeños, de color marrón, y granulada en apariencia. C) Una de ovocitos que se ha madurado con 1-metiladenina . La vesícula germinal se ha roto. D) Un cigoto rodeado por un fertsobre ilization. E) Evitar cultivos con grandes ovocitos que no puede ser debido a que estos maduraron oocitos no se eliminan por filtración. Tales ovocitos son ligeramente más pequeño que el de A. y son de color marrón más oscuro y de textura granulosa. La barra de escala en A significa 50 micras y representa la escala de imágenes AE. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Aparatos para el montaje. AA &#39;) un filtro de malla fijada a un tubo cónico de 50 ml. El extremo cónico del tubo y el centro de la tapa se cortan para permitir que los cultivos que se vierte a través del tubo y el filtro. B) Un plato de inyección construido a partir de la tapa de un 60 x 15 mm placa de cultivo de poliestireno. Un círculo dibujado alrededor del centro describe el campo de visión del microscopio de inyección y sirve como una guía para los embriones de remo. Una línea anotó into el plato es útil para romper las agujas de inyección. pipeta CC &#39;) Boca configuración. Coloque una boquilla en un extremo de un tubo de goma largo de varios pies. Colocar el otro extremo a una pipeta Pasteur, que ha sido moldeada por fusión brevemente y tirando del extremo estrecho del vidrio. D) Esquema demostrando un remo Pasteur forma pipeta ideal y anchura para promover pegarse sin dañar embriones. Al romper el extremo fuera de la pipeta tirado, es útil si el extremo se estrecha para evitar que salen de cigotos flotante lejos del plato. Todas las barras de escala denotan 3 cm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig4highres.jpg" width="400" /> Figura 4. Reactivos introducido con éxito por microinyección. A) DIC de un embrión de blástula inyectado con un plásmido reportero GFP. El embrión tiene una morfología normal. B) expre GFPsión en la imagen DIC de dos embriones en fase de blástula morfológicamente normales. d) un embrión a partir de C embrión se muestra en A. C) emite una fluorescencia de color rojo de la introducción de dextrano Rojo Texas. El otro embrión es un-inyectado y no presenta fluorescencia. Las barras de escala indican 50 micras. La barra de escala en A representa la escala de A y B. La barra de escala en C representa la escala de C y D. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. sobreinyección y resultado toxicidad de reactivos en arrestados o desarrollo aberrante. Todas las imágenes son de los embriones de 24 horas después de la inyección del mismo lote de inyección. AA &#39;) Un cigoto sobreinyectado detenido en el estadio de una célula. BB&#39;) Un embrión arrestado la escisión temprana. Un embrión sano dividirá de forma simétrica, mientras que este embrión arrestadodebido a divisiones celulares anormales. CC &#39;) Un embrión con el desarrollo tremendamente aberrante debido a la toxicidad. Mientras que este embrión se forma más o menos como un embrión de blástula (D), es asimétrico y anormalmente engrosada. DD &#39;) Un adecuadamente en desarrollo inyecta blástula embrión etapa. La barra de escala en A significa 50 micras y representa la escala para todos los paneles.

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de<em&gt; Patiria minata</em&gt; Los cigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K vistas.  Carnegie Mellon University.  Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie. 

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Investigación

Genética

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biología del Desarrollo

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Técnicas de microinyección en el pez cebra

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Un método para la microinyección de

Resumen

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