Esta investigación fue financiada por el NIH K08 AI062732, K12 HD001401, y 1UL1RR024139-02 y una beca de investigación de Salud Infantil de la Charles H. Hood Foundation para SB-M. y por la Fundación para la Investigación de la Universidad Estatal de Nueva York en Stony Brook.

1. EBV acciones de preparación <ol><li> Subcultura que crece exponencialmente B95-8 células (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 5 células / ml en un frasco de 75 cm 2 de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. Las células se cultivan en completo RPMI 1640 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), penicilina / estreptomicina en 100U/ml y 100 ug / ml, respectivamente, y anfotericina B de 0,5 mg / ml a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. </li><li> Cuarenta y ocho horas más tarde, suspender las células en fresco RPMI 1640 completo en 1 x 10 6 células / ml. Para inducir la producción de virus, estimular las células con 20ng/ml tetradecanoyl acetato de forbol (TPA) durante 1 hora en un estándar de incubadora de CO 2. Lavar las células tres veces con RPMI 1640 para eliminar la TPA. </li><li> Resuspender las células en el volumen original de RPMI 1640 completo (de 1.2) y colocar el matraz en incubadora de CO 2 durante 96 horas. Este método se ha demostrado que producen altos títulos de par virus infecciosotículos 6. </li><li> Centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4 ° C para separar EBV que contienen sobrenadante de cultivo de células. Sobrenadante del filtro a través de un filtro de 0,45 micrones, alícuota y almacenar a -70 ° C durante más de un año. Una alternativa es obtener el sobrenadante de B95-8 que contiene las células EBV de la ATCC (VR-1492) y el uso a la dilución recomendada por la ATCC. </li></ol> 2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) <ol><li> Draw 10 ml de sangre de donantes en una jeringa heparinizada o un tubo de sangre heparinizada. Diluir la sangre con 20 ml de PBS a temperatura ambiente en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Subyace la sangre diluida con 15 ml de medio de separación Ficoll Hypaque linfocitos. Centrifugar a 225 x g sin freno a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Quitar la capa leucocitaria y la transferencia a un nuevo tubo de 50 ml cónico. Suben el volumen hasta 50 ml con PBS y se giran a 600 xg a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Pour el sobrenadante. Lavar las células por la resuspensión de sedimento en 50 ml de PBS y centrifugado a 600 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar dos veces más de una manera similar. </li><li> Resuspender las células lavadas en 1 ml de RPMI completo. Use 5 l de las células para preparar una dilución 1 / 10 en azul tripán. Contador de células vivas utilizando un hemocitómetro. </li><li> Ajuste el volumen utilizando RPMI completo en un 25 cm 2 frasco de cultivo de tejido para obtener una concentración celular de 2 x 10 6 / ml. </li></ol> 3. La infección con EBV <ol><li> Añadir FK506 (AG Científica) para la suspensión celular de 2,6 a una concentración final de 20 nM. Lugar botella de CO 2 incubadora a 37 ° C durante una hora. </li><li> Rápido deshielo de una parte alícuota de este virus. Quitar frasco de la incubadora y añadir EBV a las células a dilución 1 / 10. Por lo general, esta dilución proporciona una MOI de 50 a 100. Remolino matraz para mezclar bien y colocarlo en posición vertical en incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> Nota ªen el Paso 4, realizada para predecir el resultado exitoso, es un paso opcional. Paso 4 Si va a realizar, será necesario para la incubación de un frasco adicional de la ONU infectados PBMC a 2 x 10 6 células / ml como control. 4. La identificación de la población la proliferación de las células (paso opcional) <ol><li> Preparar tampón FACS: PBS + 5% de SFB. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Hacer la siguiente mezcla de anticuerpos en un volumen de 50 l cada uno para la tinción de las células en el Paso 4.6. Diluciones de anticuerpos deben hacerse en tampón FACS contiene 1mg/ml de IgG de ratón (Sigma) para inhibir la unión no específica de los anticuerpos. <ol class="lroman"><li> solo teñidas con PE conjugado de anticuerpos anti-CD23 (1 / 50 de dilución) </li><li> solo se tiñeron con FITC conjugado anti-CD58 de anticuerpos (1 / 50 de dilución) </li><li> solo teñidas con PE-Cy5 conjugado de anticuerpos anti-CD19 (1 / 50 de dilución) </li><li> triple tinción para CD23, CD58, CD19 y (1 / 50 de cada dilución) </li><li> solo se tiñeron con el control de isotipo conjugado con PEanticuerpos coincide con CD23-PE (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD23) </li><li> solo se tiñeron con anticuerpo conjugado FITC isotipo de control coincide con CD58-FITC (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD58) </li><li> solo teñidas con PE-Cy5 anticuerpos conjugados isotipo de control coincide con CD19-PE-Cy5 (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD19) </li><li> triple-teñidas con los tres anticuerpos isotipo de control. </li></ol> Almacenar temporalmente la mezcla a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> En el tercer día posterior a la exposición a este virus, cuidado frasco agitar para obtener una suspensión celular más uniforme. Quitar 2 ml del frasco en un tubo Eppendorf de 2 ml. Girar el tubo en una microcentrífuga a 3000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS a 5 x 10 6 a 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Extraiga ocho alícuotas 50μl en tubos Eppendorf individuales o una placa de 96 pocillos de fondo en V. Tubos de centrifugado o la placa a 1500 x gdurante 3 minutos. </li><li> Descartar el sobrenadante y los tubos de vórtice / placa. Resuspender las células en cada tubo / y en 50 l de tampón FACS que contienen las diluciones adecuadas de anticuerpos preparados en 4,2. </li><li> Incubar los tubos / placa de hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se centrifuga a 3000 rpm durante 3 minutos, retire el sobrenadante y añadir 200 l de tampón FACS. Centrifugar las células de nuevo y eliminar el sobrenadante para completar el lavado. Repita dos lavados más. </li><li> Resuspender las células en 200 l FACS buffer y la adquisición de datos utilizando un citómetro de flujo, la adquisición de 20.000 eventos / tubo. </li><li> Analizar datos usando WinMDI (freeware para FACS análisis de datos en el PC). Puerta de células vivas mediante perfiles de dispersión frontal y lateral. Luego, las células viven puerta para la expresión de CD19 + (marcador de células B), después de comparar con las células teñidas con el anticuerpo control de isotipo coincide con anticuerpos anti-CD19. Parcela B CD19 + en vivo las células con la intensidad de fluorescencia de CD23 en el eje X y la intensidad de fluorescencia para CD58 en el eje. Determinar CD23 + y CD58 + en las células mediante la comparación con el EBV-expuestos células teñidas con anticuerpos isotipo emparejado control. La presencia de CD23 + CD58 hi células EBV-expuestos de cultivo (Fig. 2C) predice consecuencia el éxito de las células infectadas con EBV de crecimiento transformado. Por el contrario, CD23 hi células CD58 + no surgen cuando las células no están expuestos a este virus (Figura 2) o expuestos a una cepa no inmortalizando de EBV (Figura 2B). CD23 hi células CD58 + se han demostrado experimentalmente que someterse a la proliferación y, posteriormente, establecer LCL (14). </li></ol> 5. La expansión y la criopreservación de LCL <ol><li> Visualización de las células al microscopio óptico: Por una semana después de la infección por VEB, grupos de células son visibles al microscopio óptico. La Figura 3 muestra un ejemplo de los primeros grupos microscópicos (Figura 3B) en un matraz. </li><li> Con el tiempo, los grupos microscópicos se hacen más grandes grupos de tal manera que sean visiblesmacroscópicamente en el matraz. Figura 3C muestra grandes grupos de células en LCL establecido por microscopía de luz. </li><li> La alimentación de las células: el doble de volumen de medio de cultivo en el frasco de cultivo en el día 12. Posteriormente, ampliar la cultura mediante el aumento de su volumen de 2.3 veces con RPMI completo. </li><li> Periodicidad de las células de alimentación debe ser determinado con base en la tasa de crecimiento de las células. Cuando el medio de cultivo se vuelve amarilla, por lo general el momento de sustituir los medios de comunicación que el anterior. Normalmente, esto ocurre una vez por semana. Sin embargo, algunas líneas celulares pueden necesitar ser alimentado con más o con menos frecuencia. Ampliar la cultura de 75 a 100 ml durante las próximas semanas. </li><li> Criopreservación: Al congelar las células de las células se centrifuga a 600 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de células y resuspender el pellet en medio de un frío que contiene 90% de SFB y el 10% dimetilsulfóxido a 1 x 10 7 células / ml. Colocar el tubo en nitrógeno líquido. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Éxito está en relación con la presencia de CD23 + CD58 hi células. Aproximadamente 2.3% de células vivas en el día 3-4 después de la exposición a este virus debe tener este perfil (Fig. 2C). Otros sub-poblaciones de CD23 +, CD23 -, CD58 +, CD58 y - las células observadas después de la exposición a este virus muestran la proliferación de un mínimo de 14. Un de las células infectadas (Figura 2A) y las células expuestas a este virus de HH514-16 células (Figura 2B), que alberga una cepa no inmortalizando de EBV, no demuestran CD23 + CD58 hi células. También puede visualizar las células al microscopio óptico para controlar éxito: Como se mencionó anteriormente, dentro de una semana después de la infección por VEB, pequeños grupos de células en el matraz son visibles al microscopio óptico (Figura 3B). A medida que avanza el tiempo y las células se convierten en LCL, los grupos microscópicos se hacen más grandes (Figura 3C) de tal manera que son visibles macroscópicamente grupos en el matraz. Figura 1. Flujo de trabajo para la generación y la criopreservación de líneas de células linfoblásticas. Sangre periférica, se centrifuga a través de un gradiente de Ficoll. PBMC presente en la capa leucocitaria de un gradiente establecido se exponen a FK506 seguido por la adición de este virus. EBV-expusieron células se cultivan a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2 para establecer y posteriormente ampliar LCL para la criopreservación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> Figura 2. Identificación de una subpoblación de células B espera de someterse a la proliferación después de la exposición a este virus. Un infectados PBMC (A) o PBMC expuestos a este virus derivados de HH514-16 células (B) o de células B95-8 (C) en presencia de FK506 fueron cosechadas en el día 3. Las células se tiñeron con fluorocromo y conjugado con anticuerpos dirigidos contra CD19, CD23, CD58 y. Después de gating en células vivass, sin infección (A) y EBV-expuestos (B y C) las células B CD19 + fueron examinados para la expresión de CD23 y CD58. Una subpoblación de células B que expresan CD58 y los niveles altos de CD23 (CD23 hi CD58 +), observado sólo en las células expuestas a la transformación competente EBV (derivado de la B95-8 células), se representa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización de grupos de células en las células infectadas por EBV. PBMC fueron tratados con FK506 e infectadas con este virus. Un infectadas (A) y EBV-expuestos (B), las células fueron examinados una semana después de la infección por microscopía de contraste de fase (10 aumentos). Cinco semanas de la antigua línea de células linfoblásticas se muestra en la C.

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Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li><li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+under+influence:+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus.">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li><li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells:+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus.">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. 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No hay conflictos de interés declarado.

El método descrito en este documento genera LCL de donantes de sangre periférica, con la inmortalización rápido y los tiempos de criopreservación. Mediante el uso de FK506, un inmunosupresor de células T, y altos títulos de virus infecciosos que son capaces de promover la proliferación de las células B infectadas con EBV en las células mononucleares de sangre periférica. Estas intervenciones que el método descrito más eficiente, resultando en la rápida expansión de las células para los experimentos posteriores. Tradicionalmente, la transformación del crecimiento ha sido supervisado por la visualización de grupos de células por microscopía de luz alrededor de una semana después de la exposición a este virus 6, 15. Sin embargo, la agrupación de células no es un indicador específico de la transformación del crecimiento mediada por VEB. Hemos demostrado anteriormente identificación consistente de la población de células proliferantes mediante citometría de flujo 14, proporcionando un método preciso y específico para determinar el resultado exitoso tan pronto como tres días de popaer la exposición de las células B a este virus.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Anfotericina B </td><td> Fisher Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal, inactivado por calor </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque medios de linfocitos separación </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Científico </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG de suero de ratón </td><td> Sigma </td><td> I 8765 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD23 humano conjugado con PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Ratón isotipo conjugado con PE IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD58 humano conjugado con FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Ratón isotipo IgG1 conjugados con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD19 humano conjugado con PE-Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Ratón isotipo conjugado con PE-Cy5 IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl forbol acetato (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS buffer (fosfato 1X solución salina tamponada con + 5% de suero fetal bovino) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

Infección de las células B con el virus Epstein-Barr (EBV) conduce a la proliferación y posterior inmortalización, lo que resulta en el establecimiento de líneas de células linfoblásticas (LCL) in vitro. Desde LCL son latentes infectadas con este virus, que proporcionan un sistema modelo para investigar la latencia y el virus EBV impulsado por la proliferación de células B y la tumorigénesis 1. LCL se han utilizado para presentar antígenos en una variedad de ensayos inmunológicos 2, 3. Además, LCL se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales humanos 4, 5 y proporcionan una fuente potencialmente ilimitada cuando el acceso a materiales biológicos primaria es limitada 6, 7. Una variedad de métodos han sido descritos para generar LCL. Los métodos anteriores han incluido el uso de mitógenos como fitohemaglutinina, lipopolisacárido 8 y 9 mitógeno de hierba carmín para incrementar la eficiencia de VEB mediada por la inmortalización. Más recientemente, otros han utilizado immunosuppressive agentes, como la ciclosporina A para inhibir las células T mediada por el asesinato de las células B infectadas por 7, 10-12. El largo periodo de tiempo de la infección por EBV para el establecimiento de líneas celulares de las unidades de la necesidad de métodos más rápidos y más confiables para el VEB impulsada por la transformación B el crecimiento celular. Usando una combinación de alta EBV título y un agente inmunosupresor, que son capaces de infectar constantemente, transformar y generar LCL de las células B en sangre periférica. Este método utiliza una pequeña cantidad de células mononucleares de sangre periférica que se infectan en los cúmulos de células in vitro puede ser demostrada. La presencia de CD23 con este virus en la presencia de FK506, una célula T inmunosupresores. Tradicionalmente, la consecuencia de la proliferación de células B es controlada por la visualización de grupos microscópicos de células alrededor de una semana después de la infección con este virus. Los grupos de LCL se puede ver a simple vista después de varias semanas. Se describe un ensayo para determinar pronto si VEB mediada por grecimiento de transformación tiene éxito incluso antes de que grupos microscópicos de células se puede demostrar. La presencia de CD23 hi células CD58 + observó a tres días después de la infección indica un resultado exitoso.

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Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.

Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

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Immunology and Infection

39.8K vistas.  State University of New York at Stony Brook. Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / -</sup Y P53 - / -</sup Ratones

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Investigación

Inmunología e Infección

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...