Este método permitirá la caracterización de diferentes células inmunes en los mismos estados de enfermedad de individuos con MI, lo que ampliará nuestra comprensión del mecanismo de la infección por EBV. Demostrando el procedimiento estará Linlin Zhang, un médico de nuestro laboratorio. Para comenzar, tome los PBMC aislados previamente en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros, y gírelos a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 80 microlitros del tampón preparado. A continuación, agregue 20 microlitros de microperlas CD 14 a la suspensión celular, mezcle bien con pipeteo e incube el tubo durante 15 minutos en hielo. Luego lave las PBMC con un mililitro de tampón y centrifugar a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Deseche todo el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 500 microlitros del tampón. Para la separación magnética, coloque una columna en el separador de perlas magnéticas y prepare la columna lavándola con tres mililitros del tampón. A continuación, agregue la suspensión de celdas a la columna.
Deje que pase y recoja las células no marcadas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave la columna tres veces con tres mililitros del tampón y recoja todo el efluente en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Ahora, coloque la columna en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de amortiguador a la columna.
Empuje el émbolo firmemente en la columna para enjuagar las células marcadas magnéticamente en el tubo. Centrifugar las células marcadas magnéticamente a 300 G durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para su posterior secuenciación del transcriptoma.
Granular las células recolectadas sin marcar centrifugando a 300 G durante cinco minutos y volver a suspender las células en 100 microlitros de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, agregue dos microlitros de cada anticuerpo marcado a la suspensión celular e incube en hielo durante 30 minutos, protegido de la luz. A continuación, alícuota 100 microlitros de la suspensión de células PBMC en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para configurar una muestra de control negativo CD 3, CD 4, CD 8 y CD 19, muestras de tinción única y una muestra de tinción CD 56 o CD 16.
Luego agregue dos microlitros del anticuerpo marcado fluorescentemente correspondiente a cada tubo e incube en hielo durante 30 minutos, protegido de la luz. Después de la incubación, lave todas las células con PBS como se demostró anteriormente y vuelva a suspender en 500 microlitros de PBS. Abra el sistema de clasificación de celdas y ejecute el programa de encendido.
Luego, instale la boquilla de 85 micrómetros y abra el flujo de clasificación. Establezca el voltaje de clasificación en 4, 500 voltios y la frecuencia en 47. Configure el espacio a 8 en la ventana de separación y active el modo de clasificación automática de punto óptimo para determinar automáticamente el valor de amplitud de gotas.
Finalmente, ajuste el retardo de gota a 30.31 en la ventana de flujo lateral. Usando un diagrama de puntos de dispersión hacia adelante versus hacia el lado, dibuje la puerta de polígono P1 para identificar la población de linfocitos intacta. A continuación, utilizando un diagrama de puntos de área de dispersión hacia adelante frente a altura, dibuje la puerta de polígono P2 para identificar las celdas individuales y excluir dobletes.
Luego, usando un diagrama de puntos de área FITC de CD 19 frente a CD 3 por CPCY 5.5 area, dibuje la puerta rectangular P3 para seleccionar células T positivas de CD 3 y células B positivas de CD 19. A continuación, utilizando un diagrama de puntos de área de CD 4 APCCY 7 frente a área de PE de CD 8, dibuje una puerta rectangular para seleccionar CD 4 y células T positivas para CD 8. Finalmente, usando un diagrama de puntos de área de dispersión lateral versus CD 56 o CD 16 APC, dibuje una puerta rectangular para seleccionar células asesinas naturales positivas para CD 56 o CD 16.
Para el tubo de control negativo, haga clic en cargar en el panel de adquisición y seleccione la configuración del citómetro en el software. En la ventana del inspector, haga clic en la pestaña de parámetros y ajuste los voltajes de dispersión directa, dispersión lateral y diferentes tintes fluorescentes. Después de cargar los tubos teñidos individuales en el citómetro, haga clic en cargar en el panel de adquisición y, a continuación, haga clic en la pestaña de compensación para ajustar la compensación, como se describe en el texto.
Vortex la suspensión celular suavemente, antes de cargar el tubo en el citómetro. Agregue 200 microlitros de FBS a cuatro tubos de flujo de recolección y voltee los tubos. Colóquelos en la cámara de recolección del citómetro.
Recoja los diferentes tipos de células por separado en los cuatro tubos de flujo. Haga girar las células separadas a 300 G durante cinco minutos y agregue 200 microlitros de reactivo de aislamiento de ARN a la paleta de células para la secuenciación del transcriptoma. En el presente estudio, las subpoblaciones de células inmunes de sangre periférica de diferentes muestras se clasificaron de manera eficiente combinando las técnicas de perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia.
Es importante destacar que en este protocolo, el paso de clasificación celular se ha optimizado para mejorar la viabilidad celular. Las células inmunes clasificadas mostraron una mayor proporción de células T positivas para CD 3, CD 8 en pacientes con mononucleosis infecciosa en comparación con los portadores sanos del virus de Epstein-Barr y las muestras no infectadas. En contraste, se observó una disminución de las proporciones de células T CD 3, CD 4 positivas y células B positivas para CD 19 en pacientes con mononucleosis infecciosa en comparación con portadores sanos de VEB y niños no infectados por VEB.
Además, se observó una disminución de las proporciones de células asesinas naturales CD 56 o CD 16 positivas en pacientes con mononucleosis infecciosa en comparación con niños no infectados por EBV. Mantener la viabilidad celular es vital para el experimento posterior. Mantener las células en hielo o en el refrigerador durante el proceso de clasificación es beneficioso para la viabilidad celular.
