Nos gustaría agradecer a los Dres. James Bowie y Faham Salem para proporcionar conocimientos técnicos y la orientación sobre el método y el Dr. bicelle Aviv Paz útil para los debates. Reconocemos Le Du de apoyo experimental. Rachna Ujwal tiene interés financiero en MemX Biosciences LLC, que, sin embargo, no apoyó este trabajo. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH (SR1 GM078844).

Cristalización Bicelle base se compone de cuatro pasos básicos (Figura 2): i) la elaboración de un lípido bicelle formación: anfifilo mezcla, ii) la incorporación de la proteína purificada en el medio bicelle; iii) los ensayos de cristalización (manual o robotizada), y iv) visualización, cristal de extracción y congelación. Estos pasos se describen en detalle a continuación 1. Preparación de Bicelles Bicelles se pueden formar en una variedad de lípidos: combinaciones anfifilo y en un amplio rango de concentraciones. Por lo tanto, una composición basada en el anterior éxito inicial de las condiciones, se recomienda (Tabla 1). La mezcla de más éxito es la DMPC: CHAPSO formulación bicelle, que puede ser comprado comercialmente como un premezclado listo para usar la formulación (ver cuadro de los reactivos a continuación) o preparadas en el laboratorio como se describe. Para este ejercicio vamos a preparar 1 ml de 35% DMPC: mezcla CHAPSO en una proporción molar de 2,8:1. <ol><li&gt; Pesar 0,26 g DMPC (Sr. 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (Sr. 630,9 g / mol) y añadir agua destilada hasta un volumen final de 1,0 ml. <ul type="disc"><li> El porcentaje bicelle puede variar entre 10% -40%, con un DMPC: CHAPSO relación molar que va de 2.6-3.0:1 (Tabla 1). </li><li> Nota: Cuanto mayor sea la concentración bicelle más difícil es la disolución de los lípidos que resulta en una mayor viscosidad de la solución. Sin embargo, un concentrado de formulación bicelle puede ser ventajoso cuando la concentración de proteínas es bajo. </li></ul></li><li> Disolución de los lípidos para obtener una solución homogénea requiere un esfuerzo considerable, por lo que este paso la mayor parte de tiempo en el método bicelle. Ciclo a través de los siguientes pasos hasta que la DMPC se mezcla por completo: <ol><li> Calentar la mezcla a 40 ° C usando un baño de agua o una incubadora y el vórtice de ~ 1 minuto. <ul type="disc"><li> Nota: A medida que los ciclos se llevan a cabo, el calentamiento de la mezcla se traducirá en una estafa similar al gelconsistencia por lo que es difícil de vórtice. </li></ul></li><li> Enfriar la mezcla de hielo y agitar durante unos minutos. Refrigeración ayuda a licuar la solución por lo que es más fácil de vórtice. <ul type="disc"><li> Nota: A medida que los ciclos se llevan a cabo, la mezcla puede volverse turbia al enfriarse. </li></ul></li><li> Repita los pasos anteriores (1.2.1 y 1.2.2) hasta que los lípidos se disuelva por completo. <ul type="disc"><li> Nota: Este proceso puede tardar varias horas. Formación Bicelle es indicado por los cambios en el comportamiento de las fases de la DMPC: formulación CHAPSO. Al terminar, la mezcla será un gel transparente en o por encima de la temperatura ambiente y un líquido viscoso en el hielo. </li></ul></li></ol></li><li> La mezcla de bicelle ya está listo para usar y puede ser conservada a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo (hasta 5 años). Debido al riesgo de la hidrólisis del grupo de cabeza de fosfolípidos, que no es recomendable para almacenar bicelles a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo. </li></ol> 2. La incorporación de la proteína en bicelles La mayoría de las estructuras MP obtenidos a partir de bicelles se cristalizaron en DMPC: CHAPSO concentración bicelle que van desde 2 a 8% con una concentración de proteína de 8 a 12 mg / ml (Tabla 1). Si es posible, pantallas iniciales deben utilizar estas directrices y las concentraciones adicionales pueden ser examinados en la fase de optimización. En comparación con el método de LCP, la incorporación de proteínas con bicelles es un proceso simple (Figura 3), que debe hacerse el mismo día de ensayos de cristalización. <ol><li> Descongele la DMPC: CHAPSO mezcla bicelle a temperatura ambiente hasta los cambios de fase de un gel transparente. <ul type="disc"><li> Nota: Varios de congelación y deshielo no afecta el comportamiento bicelle. </li></ul></li><li> Colocar la mezcla en hielo para licuar y agitar brevemente para restablecer una fase homogénea bicelle. Cuando se coloca en el hielo, la mezcla puede llegar a ser nublado. </li><li> From este punto, mantener la mezcla bicelle y la proteína purificada en el hielo. Esto evitará que la bicelle en una fase líquida por lo que es susceptible de pipeteo. </li><li> Añadir la mezcla de bicelle a la purificada detergente solubiliza proteínas en un 1:4 (V / V) la relación. <ul type="disc"><li> Por ejemplo: 100 l de proteínas bicelle mezcla se obtiene mediante la mezcla de proteína de 80 l con 20 l bicelle. Si la concentración de proteínas es de 15 mg / ml y la concentración bicelle es del 35%, esto le dará una mezcla de proteínas-bicelle incorporado con una concentración de proteínas de 12 mg / ml y una concentración bicelle del 7%. </li></ul></li><li> Mezclar suavemente el contenido de pipeteo arriba y hacia abajo hasta que la solución se vuelva clara y homogénea. <ul type="disc"><li> Nota: Si aparecen burbujas, una vuelta rápida (30-60 segundos, 13000 rpm, 4 º C) con una centrífuga de mesa puede ayudar a eliminarlas. </li></ul></li><li> Incubar la mezcla en hielo durante al menos 30 minutos para promover la plena incorporación de proteína de into bicelles. La mezcla de proteínas bicelle ya está listo para los ensayos de cristalización. </li></ol> 3. El establecimiento de ensayos de cristalización Otras técnicas de cristalización de lípidos como el LCP requieren equipo especializado debido a la alta viscosidad del medio, pero el comportamiento de fase única de bicelles permite la aplicación en prácticamente cualquier formato estándar de la cristalización, la robótica (Figura 3). Ensayos de cristalización puede llevarse a cabo tanto en la horca o sentado formatos soltar con las pantallas de los disponibles en el mercado. <ol><li> Si la creación de bandejas manualmente o con un robot de cristalización, mantener la mezcla de proteínas-bicelle en el hielo. Esto evitará que el frío mezcla de proteínas-bicelle y asegurar que la viscosidad de la solución es mínima. </li><li> Ensayos Manual de cristalización - Con una pipeta estándar, la mezcla de proteínas bicelle se puede mezclar con una solución de reserva de la misma manera como realizan normalmenteed de proteínas de membrana soluble o solubilizada en detergente. <ul type="disc"><li> Nota: Mantenga la mezcla de proteínas-bicelle en el hielo durante los ensayos. </li></ul></li><li> Los ensayos de cristalización robótica - Hemos diseñado estos ensayos para que el robot de cristalización de mosquitos, pero en principio (después de las mismas precauciones), la técnica debe ser compatible con todos los robots de cristalización. Los siguientes consejos se asegurará de que la mezcla de proteínas bicelle se mantiene fresco y con precisión una pipeta por el robot: <ol><li> Preenfriar la placa de sujeción de la mezcla de proteínas-bicelle colocándolo en el hielo. </li><li> Pipetear la mezcla de proteínas-bicelle en la placa y seguir manteniendo la placa de hielo. Este plato debe ser el último elemento para ir en el robot antes de comenzar la carrera. </li><li> Puesta en marcha de la bandeja de depósito y las tapas de cristalización en la plataforma de 3 y 5, respectivamente, del robot mosquito. </li><li> Colocar la placa que contiene proteínas bicelle mezcla en la plataforma 4del robot mosquito. Esto asegura que la mezcla de proteínas-bicelle es el último en ser recogidos por el robot y es puesto en libertad inmediatamente. </li><li> Para evitar un calentamiento y aumento de la viscosidad, no se mezclan el depósito con la mezcla de proteínas bicelle. </li><li> Cuando se realizan múltiples pantallas, de inmediato a la placa bicelle en proteínas de hielo para enfriar tan pronto como ya terminada la carrera. </li></ol></li><li> Volumen de la gota y la relación (proteínas: depósito) pueden ser elegidos como para los ensayos de cristalización convencional. Por ejemplo, los ensayos iniciales de cristal con el robot de mosquitos pueden ser establecidas con 0,25 l de proteínas: mezcla bicelle más 0,25 l embalse. </li><li> Incubar los ensayos de cristal en una cámara a 20 º C. La temperatura es una buena selección y optimización de parámetros debido a que el comportamiento de la fase de bicelles depende de la temperatura. <ul type="disc"><li> Las temperaturas más altas inducen la fase laminar 12 (Figura 1), que tiene la ventaja de pre-organizaciónla proteína en capas. Temperaturas inferiores a 20 ° C pueden ser revisados, pero usted no debe ir por debajo de 4 ° C ya que esto puede causar que los lípidos para precipitar durante largos períodos de tiempo. </li></ul></li><li> De la misma manera como los ensayos de cristalización tradicionales, los ensayos bicelle deben ser controlados de forma regular para la aparición y crecimiento de cristales. Se recomienda comprobar las bandejas en la 1 ª y 3 º día posterior a la instalación seguido de una inspección semanal. </li><li> Optimización de cristal puede ser llevado a cabo utilizando métodos de rutina utilizados para los cristales de detergentes incluyendo la investigación la red, la detección de aditivos, el cambio de temperaturas, etc Además, el porcentaje bicelle y proteínas: relación bicelle puede variar. Además, bicelles puede ser dopado con lípidos específicos que puedan ser necesarios para la estabilidad de la proteína o la función. </li></ol> 4. Visualización, cristal de extracción y congelación Dado que los ensayos de cristal con la mezcla de proteínas-bicelle<html> tiene una viscosidad similar a las gotas de detergente en proteínas, la visualización y extracción de cristal es de rutina y se lleva a cabo como las tradicionales configuraciones. <ol><li> Visualización: A diferencia de los medios de comunicación LCP que a menudo requiere de alta calidad de iluminación con la luz normal y polarizada para la detección de cristal, la visualización no se vea obstaculizado por bicelles. Gotas de proteínas de colores, así como cristales incoloros pueden ser fácilmente analizados utilizando microscopios estándar y no requiere equipo especial es. </li><li> Bicelles, al igual que otros medios de lípidos, tienden a producir un alto porcentaje de falsos positivos. Un microscopio UV ayuda mucho en la diferenciación de las proteínas a partir de cristales de sal (Figura 4). </li><li> Extracción y congelación: la extracción de cristal y la congelación es relativamente sencillo y no requiere la disolución de los medios de comunicación bicelle alrededores. Además, la fase de bicelle sí ofrece algunos moderados crio-protección. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <html> nt &quot;&gt; Por lo general, tarda 2-3 días para los cristales que aparecen y aproximadamente una semana o más para que puedan crecer a su tamaño máximo. Este fue el caso de bacteriorodopsina y el ratón dependientes de voltaje del canal de aniones 1 (mVDAC1) cristales de 4,8 . Para otras proteínas de membrana que puede tomar varias semanas para que el crecimiento de cristales, lo que es importante continuar monitoreando los ensayos de cristal mucho más allá de las primeras semanas. Al igual que con otros medios lipídicos, bicelles tienden a formar las formas que puede parecer ser cristalina. También se ha observado que conducen a un mayor porcentaje de sal y los cristales de detergente. A UV-microscopio de fluorescencia que detecta el triptófano puede ayudar significativamente a eliminar tales no proteínico de falsos positivos. La figura 4 muestra las formas de lípidos, la sal y cristales de proteínas como se ve en la luz visible y UV para ayudar a distinguir los diferentes resultados que se pueden observar. 83fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Bicelle esquemática. Bicelles se componen de una molécula de bicapa lipídica que forman como DMPC (azul) y un anfifilo como CHAPSO (verde), que protege los bordes hidrofóbica de la bicapa. A medida que la temperatura se incrementa, en forma de disco bicelles someterse a una transformación de fase en un 12 hoja laminar perforada. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama de flujo para el método de cristalización bicelle esbozar los cuatro pasos básicos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> Figura 3. Ensayos de cristal puesta en marcha de esquemas. Purificado detergente solubiliza proteínas de la membrana puede ser directamente mezclado con el hielo bicelles simplemente pipetear los contenidos juntos. Después de incubar la mezcla de proteína / bicelle en el hielo para los ensayos de cristalización a 30 minutos,se puede configurar con cualquier formato estándar, incluyendo la robótica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> Figura 4. Visualización de los ensayos de cristal. Imagen visible (arriba) y la imagen ultravioleta (panel inferior) de la (A) la aguja en forma de cristales observados en una condición de la sal solamente. No se puede detectar la fluorescencia de los cristales, una indicación de falsos positivos. (B) en forma de bastón cristal que se forma en una condición de MPD. El cristal de fluorescencia débil pero se encontró que no proteínico usando difracción de rayos X. (C) Crystal observado unas cuatro semanas después de la creación de los juicios. El fuerte fluorescencia bajo luz UV confirma que es un cristal de proteína. <table border="1"><tbody><tr><td> No. </td><td> Proteína </td><td> Fuente </td><td> Formulación Bicelle </td><td> Concentrados de proteínasen </td><td> Detergente 1 </td><td> Resolución (Å) </td><td> Referencia </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bacteriorodopsina 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2.0 </td><td> Faham y Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1.8 </td><td> Faham et al., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrenérgico / complejo Fab </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Dependientes de voltaje anión canal 1 </td><td> Mus musculus </em&gt; </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2.3 </td><td> Ujwal et al., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, el 5% NM </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1.9 </td><td> Luecke et al., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Romboidal de la proteasa </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Glucósido nonil </td><td> 1.7 </td><td> Vinothkumar de 2011 </td></tr></tbody></table> Un detergente que se usa para la purificación de proteínas de membrana Dos los lípidos de las membranas nativas morado puede ser llevado a lo largo de durante la purificación Tabla 1. Resumen de las condiciones de cristalización de estructuras de proteínas de membrana resolver con bicelles.

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	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Bicelles son un medio único lipídica que ofrecen un nativo de doble capa como el medio ambiente, mientras se comporta como si solubilizada por detergentes. Esta propiedad ofrece bicelles una clara ventaja sobre otros métodos de cristalización a base de lípidos ya que no hay curva de aprendizaje o el equipo especializado necesario para esta técnica. Una vez bicelles están disponibles, ya sea comercial o preparada en el laboratorio, que puede mezclarse directamente con la proteína purificada y desde este punto en ...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

Las proteínas de membrana (MP) juegan un papel crítico en muchos procesos fisiológicos tales como el bombeo de moléculas específicas a través de la bicapa de la membrana impermeable de lo contrario que rodea todas las células y orgánulos. Alteraciones en la función del resultado de los parlamentarios en muchas enfermedades y trastornos humanos, por lo tanto, una comprensión compleja de sus estructuras sigue siendo un objetivo fundamental para la investigación biológica. Sin embargo, la determinación de la estructura de los diputados sigue siendo un reto significativo a menudo se derivan de su hidrofobia. Los diputados tienen importantes regiones hidrofóbicas incrustado dentro de la bicapa. Los detergentes son utilizados para solubilizar las proteínas de la bicapa de la generación de una micela proteína-detergente, que luego pueden ser manipulados de una manera similar a las proteínas solubles. Tradicionalmente, los ensayos de cristalización proceder con una mezcla de proteínas-detergente, pero a menudo se resisten a la cristalización o producir cristales de mala calidad. Estos problemas surgen debido a lala incapacidad del detergente para imitar adecuadamente las dos capas que resulta en una pobre estabilidad y la heterogeneidad. Además, los escudos de detergente de la superficie hidrofóbica del MP la reducción de la superficie disponible para los contactos de cristal. Para evitar estos inconvenientes los parlamentarios se pueden cristalizar en los medios de lípidos, lo que más simula el entorno endógeno, y se ha convertido recientemente en una técnica de novo para la cristalización MP. Lipídica fase cúbica (LCP) es una bicapa lipídica de tres dimensiones penetrado por un sistema interconectado de canales acuosos 1. Aunque monoolein es el lípido de la elección, los lípidos relacionados, como monopalmitolein monovaccenin y también se han utilizado para hacer LCP 2. Los diputados se incorporan a la LCP, donde se difunden en tres dimensiones y núcleos cristalinos de alimentación. Una gran ventaja de la LCP es que la proteína permanece en un ambiente más nativos, pero el método tiene una serie de inconvenientes técnicos, incluyendo visc altaosity (que requieren aparatos especializados) y las dificultades en la visualización de cristal y la manipulación de 3,4. Debido a estas dificultades técnicas, se utilizó otro medio lipídico para la cristalización-bicelles 5,6 (Figura 1). Bicelles son mezclas de lípidos / anfifilo formado mediante la mezcla de un lípido fosfatidilcolina (DMPC), con un anfifilo (CHAPSO) o un lípido de cadena corta (CDPS). Dentro de cada disco bicelle, las moléculas de lípidos generar una bicapa, mientras que la línea de las moléculas de anfifilo los bordes apolar que proporciona las propiedades beneficiosas de las dos bicapas y detergentes. Es importante destacar que, por debajo de su temperatura de transición, bicelle mezclas de proteínas tienen una viscosidad reducida y se manipulan de una manera similar como solubilizadas en detergente diputados, por lo que bicelles compatible con los robots de cristalización. Bicelles se han utilizado con éxito para cristalizar proteínas de membrana varios 5,7-11 (tabla 1). Esta colección cada vez mayorde las proteínas demuestra la versatilidad de bicelles para cristalizar tanto alfa como beta helicoidales y los diputados hoja de fuentes procariotas y eucariotas. Debido a estos éxitos y la sencillez de alto rendimiento de la aplicación, bicelles debe formar parte del arsenal de todo cristalógrafo proteínas membrana. En este video, se describe la metodología bicelle y proporcionar un protocolo de paso a paso para la creación de alto rendimiento de los ensayos de cristalización de los diputados purificada mediante robots estándar.

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicelles son mezclas de lípidos / anfifilo que mantienen las proteínas de membrana (MP) dentro de una bicapa lipídica, pero tienen un comportamiento de fase única que facilita la selección de alto rendimiento de los robots de cristalización. Esta técnica se ha producido con éxito una serie de alta resolución de estructuras de ambas fuentes procariotas y eucariotas. Este vídeo describe los protocolos para la generación de la mezcla lipídica bicelle, la incorporación de los diputados en la mezcla de bicelle, el establecimiento de ensayos cristalizaciones (de forma manual, así como un robot) y los cristales de la cosecha de la media.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.5K vistas.  University of California Los Angeles. Bicelles son mezclas de lípidos / anfifilo que mantienen las proteínas de membrana (MP) dentro de una bicapa lipídica, pero tienen un comportamiento de fase única que facilita la selección de alto rendimiento de los robots de cristalización. Esta técnica se ha producido con éxito una serie de alta resolución de estructuras de ambas fuentes procariotas y eucariotas. Este vídeo describe los protocolos para la generación de la mezcla lipídica bicelle, la incorpor...

Video: High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Investigación

Biología

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

La detección de los genes miARN objetivos en de alto rendimiento utilizando el ensayo 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...