Hay muchos que contribuyeron a este trabajo y la mayoría son de la membrana Caffrey estructurales y el Grupo de Biología Funcional, ambos miembros pasados ​​y presentes. A todos les extendemos nuestro más sincero agradecimiento y aprecio. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), los Institutos Nacionales de Salud (GM75915), y la Universidad de Limerick.

Un punto importante en el área de la biología estructural y funcional de la membrana biológica (Figura 1). La membrana que rodea las células y orgánulos subcelulares cuando está presente, es una estructura molecular fina sólo dos moléculas de lípidos en todo y está repleta de proteínas. Estructura y la función que se aplican tanto a los lípidos y las proteínas son de interés. Sin embargo, el foco de este artículo se limita a las proteínas de membrana. Una mejor comprensión de cómo las proteínas de membrana de función a nivel molecular se busca por dos razones. En primer lugar, está la satisfacción intelectual de saber cómo funcionan. En segundo lugar, por saber cómo funciona una proteína, siempre existe la posibilidad de ser capaz de arreglar lo que funciona mal o de mejorar o incluso modificarlo para aplicaciones particulares. El diseño de fármacos es un resultado obvio de este tipo de trabajo. Un método para averiguar cómo una proteína de membrana trabaja a nivel molecular para determinar su estructura. Esto implica establecer el lugar en el espacio de 3 dimensiones de todos los átomos, o por lo menos todos los átomos no hidrógeno, que forman la proteína. El método que usamos para este propósito es macromoleculares cristalografía de rayos X (MX). La figura 2 muestra un ejemplo de una proteína de membrana cuya estructura se determinó a través MX. Un cristal de la calidad de la difracción de la proteína es necesaria para hacer MX. Está claro que hay muchos pasos implicados en la determinación de la estructura utilizando cristalografía macromolecular. Esto se ilustra en la Figura 3. Por lo general, estos incluyen la identificación de un objetivo de proteína de la membrana, y luego la producción, purificación y cristalización del mismo. Medidas de difracción se llevan a cabo en el cristal con una casa o una fuente de sincrotrón de rayos-X. Los datos de difracción se procesan produciendo un mapa de densidad de electrones que se ajusta entonces con un modelo molecular. El modelo, al refinado, puede ser utilizado para explorar el mecanismo de acción de la proteína y de la estructura basada en el diseño de fármacos. El enfoque de este artículo es mostrar cómo producir cristales de difracción de la calidad de las proteínas de la membrana lipídica con mesofases, por el llamado método de meso. Una reciente revisión del método y su alcance está disponible en la Referencia 1 (Caffrey, 2009). El protocolo de paso a paso vamos a seguir aquí se describe en la Referencia 2 (Caffrey y Cherezov, 2009). Un diagrama de flujo que resume los pasos a seguir y el tiempo requerido para establecer un juicio en el meso cristalización de proteínas de membrana se muestra en la Figura 4. Este artículo cubre los pasos cerrados por líneas discontinuas de color rojo. Parte 1: Preparación de las placas de cristalización <ol><li> Posición de un portaobjetos de microscopio silanizada en el banco de trabajo. </li><li> Quite la cubierta del papel de protección de una superficie de una tira de cinta perforada de doble barra espaciador (disponible en el mercado, véase el cuadro de los reactivos y equipos específicos más adelante). </li><li> Coloque la cinta, el lado pegajoso hacia abajo, en contacto con la superficie de la diapositiva. </li><li> La presión de sellado de la cinta a la diapositiva con un rodillo o rodillo. Papel de aluminio se pueden colocar entre la cinta y el rodillo para proteger la base de los pozos. </li><li> Quite la cubierta del papel de la segunda cinta para exponer la superficie adhesiva superior. </li><li> Lugar individual cubreobjetos silanizada en las proximidades de la placa de sellado rápido y eficiente de los pozos tan pronto como se termine la carga. </li></ol> Parte 2: Preparación de la jeringa de lípidos <ol><li> Lugar de los lípidos (a menudo monoolein) en un bloque de temperatura controlada a 45 ° C durante 3 minutos para que sea fundido. </li><li> Mientras que los lípidos se está derritiendo preparar dos de 100 l Jeringas de gas Hamilton para su uso en el paso de los lípidos en proteínas de mezcla. Retire el casquillo de teflón de la jeringa que contiene la solución de proteína. Coloque la jeringa que se llevará a cabo los lípidos al lado de él (dejando a su férula en su lugar). </li><li> Conecte el acoplador (véase la tabla de los reactivos y equipos específicos y de referencia por debajo de 3 (Cheng et al., 1998)) a la jeringa de lípidos. Apretar el acoplamiento a la jeringa, pero no apriete en exceso. Retire el émbolo del barril de la jeringa de lípidos. </li><li> Tenga en cuenta que los lípidos debe ser fundida antes de proceder. Conjunto de la pipeta a 30 l y poco a poco ocupan aproximadamente 30 l de lípidos fundidos. Lentamente entregar la mayor cantidad de lípidos fundidos como usted puede en el extremo abierto de la jeringa con cuidado de no introducir burbujas de aire. </li><li> Coloque el émbolo en el cañón en contacto con el lípido fundido y avanzar lentamente el émbolo del barril de la jeringa en posición vertical como se demuestra en el vídeo. Las burbujas de aire que puede quedar atrapado por inadvertencia debe levantarse en el proceso y ser puesto en libertad. </li><li> Con cuidado, determinar el volumen de los lípidos en la jeringa mediante la lectura de las marcas en el cuerpo de la jeringa. </li><li> Deslice el ferrUle en la aguja que se extiende desde el empalme. Utilice el émbolo para el lípido fundido el cañón y lenta y suavemente en la aguja en el centro del acoplador. </li></ol> Parte 3: Preparación de la jeringa de proteínas <ol><li> La solución de proteína se debe girar a 14.000 g durante 5 a 10 minutos a 4 ° C para eliminar los agregados grandes antes de la creación de ensayos de cristalización. Retire la solución de proteína del hielo y deje que se equilibre a temperatura ambiente. </li><li> Calcular el volumen de la solución de proteínas de usar para formar la fase cúbica en o cerca de la hidratación completa. Para monoolein a 20 ° C, la hidratación con agua se produce en el agua cerca del 40% (en masa) como en el diagrama de fase 5 (Figura 5). </li><li> Con una jeringa de 25 o 50 L Hamilton tomar el volumen necesario de solución de proteína. Transferir la solución en la punta de teflón del émbolo en el cilindro de la jeringa de proteínas, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire. </li><li> Con cuidado, retire la aguja y medir el volumen de la solución de proteína en la jeringa. Que debe coincidir con el valor proporcionado en el paso anterior. </li><li> Poco a poco centímetros de la solución de proteína por el cañón para terminar a ras con el extremo abierto. </li><li> Enroscar la jeringa que la proteína en el extremo abierto del acoplamiento unido a la jeringa de lípidos. Es muy importante que el dispositivo no excesivamente apretado. Apretar demasiado el dispositivo montado mezcla en esta etapa puede dañar los casquillos y causar fugas. Menores de apretar también dará lugar a una fuga. </li></ol> Parte 4: Solución de proteínas y lípidos de mezcla: Hacer que la mesofase <ol><li> Para efecto de la mezcla, el avance del émbolo en la parte de proteína de la unidad montada de mezcla al límite, con el pulgar o el dedo índice de la conducción de la solución de proteína de la jeringa de proteínas, a través del acoplador y en la jeringa de lípidos. </li><li> El émbolo en la parte lipídica ahora se utiliza para conducir el contenido de la jeringa de lípidos de vuelta a través del enganche y con la jeringa de proteínas. </li><li> El proceso se repite muchas veces, de vez en cuando, un centenar de pasajes o más son necesarios para producir una mesofase homogénea. En el comienzo de la mezcla, el movimiento de material de ida y vuelta a través del acoplador puede ser desigual y, a veces, la fuerza extra que se necesita para llevar a cabo la mezcla. Mezcla inicial suele ir acompañada por el desarrollo de una nubosidad no uniforme en la muestra. Como la homogeneización progresa, la textura se vuelve más uniforme y característica de la fase cúbica viscoso, al igual que el aspecto visual de la mesofase emergentes cúbicos. </li><li> Si las condiciones son adecuadas y las formas de fase cúbica, la dispersión debe aparecer ópticamente transparente en la jeringa. Por lo tanto, las marcas en el cuerpo de la jeringa debe ser claramente legible a través de la mesofase en el barril. </li><li> Enfriamiento muy leve de la muestra durante la mezcla mediante la colocación de la mesa de mezclas jeringa por un corto tiempo en el hielo puede acelerar la homogeneización y el logro de la transparencia. Sin embargo, es importante que no se enfríe la muestra. </li><li> Se debe tener cuidado para evitar la mezcla muy fuerte, ya que esto puede hacer que la temperatura de la muestra en aumento debido al calentamiento por fricción 3. </li></ol> Parte 5: Carga del dispensador <ol><li> Retire la aguja y el émbolo de una jeringa de 10 l Hamilton. Dejar el casquillo de teflón en el lugar. </li><li> Retire la tuerca de retención del distribuidor con la ayuda de una moneda pequeña. </li><li> Con el brazo de trinquete retirado completamente, inserte la jeringa - sin su émbolo y la aguja - a través del anillo de sujeción del distribuidor. </li><li> Vuelva a colocar la tuerca de retención, frente a la junta de lado la jeringa, y el tornillo de fuerza en el extremo abierto de la jeringa. Se debe tener cuidado para asegurarse de que la jeringa esté bien centrada en el anillo de sujeción y de que el barril se alinea paralelo al brazo de trinquete. Ambos pueden ser juzgados por los ojos. Estos dos requisitos son fundamentales para evitar las fugas. </li><li> Pase el émbolo a través de la arandela de sujeción con la tuerca de sujeción desenroscar un par de vueltas y la guía del émbolo en el extremo abierto de la jeringa. Presione el brazo de trinquete en su totalidad. Mover el émbolo en el cañón y comprobar que se desplaza libremente y verdadero en el barril. Puede ayudar a aflojar el tornillo de la barra de guía para facilitar el émbolo se mueva libremente. Asegúrese de que lo hace. El émbolo hasta que la punta de teflón se alinea con la línea de graduación cero l en el barril. Si el tornillo de la barra guía se aflojó, se vuelva a apretar una y otra vez que el émbolo se mueve libremente. </li><li> Mover el émbolo en un lado de la unidad montada de mezcla para la marca de graduación l cero a la transferencia de la mesofase a la otra jeringa y el acoplador. </li><li> Desconecte la jeringa vacía (con su férula en su lugar) de la unidad de mezcla y de inmediato conecta la jeringa cargada - con un acopladorttached - a la terminación de rosca de la jeringa de 10 l de dispensación. El grado de rigidez con la que el acoplamiento se lleva a cabo es fundamental, como ya se señaló. </li><li> Cargue la jeringuilla con el émbolo de la jeringa de 100 l para que las transferencias mesofase a través del acoplador. </li><li> Asegurar un corto, la aguja de punta plana para la terminación de acero de la jeringuilla y cuidadosamente apriete en su lugar. </li><li> Sujete el émbolo para el brazo de trinquete apretando la tuerca de la arandela de sujeción. Se debe tener cuidado de no sobre-apretar la tuerca, ya que esto puede marcar y deformar el émbolo éste no podrá utilizarse. Es importante que el rango de los viajes siempre en el brazo de trinquete en la condición fijada se limitará a no más de una pulgada, como se demuestra en el vídeo. Más allá de esto, el émbolo tiene una tendencia a la hebilla y la entrega puede fallar. </li><li> Presione el tambor de carraca en varias ocasiones para avanzar el émbolo en el barril, con lo que llenar el volumen vacío de la aguja y la carga de la aguja. Este paso se debe repetir (hasta diez veces) hasta que una cadena continua de la mesofase sale de la punta de la aguja. </li><li> Ensayos de cristalización debe comenzar de inmediato, ya que algunas proteínas son inestables en la fase cúbica sin precipitante añadido. </li></ol> Parte 6: Configuración de Placas de Cristalización <ol><li> Colocar una placa de cristalización de varios bien y cubreobjetos sobre una superficie elevada a unos cuantos centímetros por encima de la mesa de trabajo para facilitar la carga. Un contraste óptimo y mejorar la visibilidad se consiguen cuando la superficie está un poco oscuro. </li><li> Homogeneizar las soluciones precipitantes y destape los frascos. Establecer el desencadenante pipeta de dosificación a 1 mL. </li><li> Con la jeringa dosificadora en posición vertical en una mano, utilice la mano libre para la posición de la punta de la aguja en el centro y justo encima de la base del número y 1. Pulse el botón del expendedor de la repetición de expulsar a un bolo de mesofase en la superficie del vidrio. El volumen del bolo es de 200 nL cuando el dispensador estándar de repetir se utiliza con una jeringa de 10 mL. La punta de la aguja no debe ser mayor de unos cientos de micras por encima de la base del bien para garantizar la entrega correcta. </li><li> Después de 4 pozos adyacentes están llenas de mesofase, colocar 1 l de solución de precipitación en la parte superior de cada bolo mesofase usando una pipeta de 2-l y el nivel puntas desechables. </li><li> Tan pronto como sea posible, coloque un cubreobjetos de lleno en los pozos llenos para cubrir de manera uniforme. Para efectuar un sellado hermético, use una espátula para aplicar presión sobre el cubreobjetos donde hace contacto con la superficie expuesta de la cinta adhesiva espaciador. </li><li> La mesofase y precipitado proceso de dosificación se puede repetir hasta que todos los pozos de la placa se cargan y se sellan. </li><li> Etiqueta de la placa claramente con fines de seguimiento. Sensibles a la luz las proteínas son generalmente manejados por envolviendo las placas en papel de aluminio antes de colocarlas en la cámara de incubación. </li><li> Coloque las placas en una cámara de temperatura controlada, por lo general a 20 ° C. </li><li> En un horario regular, inspeccionar los pozos para el crecimiento de los cristales usando un microscopio de luz polarizada con un objetivo de 10 o 20 veces. La programación utilizada en el laboratorio del autor es la siguiente: el día 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 y 60 posterior a la instalación. Inspeccione cuidadosamente el bolo mesofase ajustar la profundidad de foco dentro de la muestra 0,14 mm de espesor. El examen debe hacerse tanto en la luz normal y entre los polarizadores cruzados. </li></ol> Parte 7: Resultados de Representante La aparición de los cristales resultantes pueden variar con el color propio de la proteína de la membrana, la polarización de la luz utilizada para la inspección (o su ausencia) y el método y la calidad de la iluminación. La Figura 6 muestra varios aspectos de cristal posible. Proteínas de la membrana de colores naturales que crecen en meso cuando se ve con luz normal puede verse como los que se muestran en la Figura 6 (Grupos B y D). Cristales incoloros proteína de membrana que crece en la fase cúbica cuando se ve con luz normal puede verse como los que se muestran en la Figura 6 (Grupo E). Por último, incoloro cristales de proteína de membrana que crece en meso cuando se ve con luz polarizada puede verse como la figura 6 (paneles A y C). Los próximos pasos en el proceso general de determinación de la estructura son de la cosecha y la crio-fría los cristales y para registrar y analizar difracción de rayos X de ellos. Estos temas deben ser incluidas en los artículos JoVe separado. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representación esquemática de una membrana biológica que muestra la bicapa lipídica y en la que se encuentran una variedad de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La estructurade la vitamina B 12 proteína transportadora, BtuB, resuelto con MX y los cristales cultivados por el método meso 6 se ilustra en este artículo Jove. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. El ciclo de estructura-función ilustra muchos de los pasos necesarios para obtener y utilizar la información completa sobre la estructura de una proteína. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. El diagrama de flujo resume los pasos involucrados en la producción de cristales de proteína de la membrana por el método meso. Sólo los pasos rodeado por la línea discontinua de color rojo están cubiertas en este artículo Jove. De referencia 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Simplificado de temperatura-composición para el diagrama de fase lipídica (monoolein) / sistema de agua. Ensayos de cristalización se establecen a 20 ° C en los lípidos saturados con agua en un 40% de hidratación. El diagrama de fase más amplia se encuentra en la Referencia 5. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Cristales de proteínas de membrana que crece en la mesofase lipídica. (A) de vitamina B 12 proteína transportadora, BtuB 6, (b) que recoge la luz del complejo II 7, (c) la OPCA adhesina / invasina 8, (d) bacteriorodopsina 9, (e) un transportador de hidratos de carbono a partir de Pseudomonas. Las imágenes grabadas con luz normal (b, d, e) y entre los polarizadores cruzados (a, c).

<ol>
	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

La fase cúbica es un entorno delicado y dinámico que puede cambiar drásticamente con la alteración de una serie de variables. No es posible dar una descripción de la configuración de los ensayos de cristalización meso en el modo manual que describe todos los posibles escollos. Sin embargo, las dificultades se pueden evitar muchos de práctica de la técnica antes de aplicarla a las soluciones de proteínas caro y con moderación en la presión aplicada a las jeringas durante la mezcla. Hecho correctamente, el método de meso puede producir cristales de una gran variedad de proteínas, cuyo número aumenta constantemente. La descripción dada aquí de la configuración de los ensayos de cristalización meso se centra en el modo manual. El proceso puede ser, ya menudo se ha modificado para facilitar la instalación automática de las placas de cristalización en aquellos casos que requieren de gran escala de detección de condiciones de cristalización.

* Los detalles para el mecanizado completo de su propio acoplamiento estrecho orificio se proporcionan en la referencia 3.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

Un protocolo detallado para la cristalización de proteínas de la membrana lipídica mediante el uso de mesofases se describe. Este método ha sido diversamente conocida como la fase cúbica lipídica o en el método de meso. El método ha demostrado ser muy versátil ya que se ha utilizado para resolver los rayos X las estructuras cristalográficas de proteínas procariotas y eucariotas, las proteínas que son monoméricos, homo y hetero-multimérica, cromóforo que contienen cromóforos y libre, y alfa -helicoidal y las proteínas beta-barril. Los recientes éxitos con la cristalización meso son los de la ingeniería beta2-adrenérgicos y los receptores de adenosina A2a acoplados a proteínas G. Protocolos se presentan para la reconstitución de la proteína de la membrana en la mesofase monoolein basado en, y para la creación de cristalizaciones en el modo manual. Medidas adicionales en el proceso global, como la cosecha de cristal, se abordan en los artículos de vídeo en el futuro. El tiempo necesario para preparar la mesofase proteína-cargado y la creación de una placa de cristalización de forma manual es de aproximadamente una hora.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases at JoVE.com

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

29.8K vistas.  Trinity College Dublin. Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Video: Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Investigación

Biología

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...