Los autores desean agradecer a la vida Freimann Science Center y el Centro de Investigación para el personal de pez cebra para su cuidado y mantenimiento del pez cebra.

1. Volver a suspender Morpholino <ol><li> Diluir 300 nM de fluoresceína-etiquetados morfolino en 100 l de agua libre de nucleasa para hacer una solución mM aproximadamente 3. La solución morfolino se repartió en alícuotas en tubos de microcentrífuga múltiples sellados en parafina y se almacena a temperatura ambiente y lejos de la luz. </li><li> Para determinar la concentración exacta morfolino, diluir 5 l de solución morfolino (o agua como un espacio en blanco) en 95 l de 0,1 N HCl. Establecer una línea de base en un espectrofotómetro a 265 nm con el blanco de agua y luego determinar la lectura de la solución diluida de morfolino. Multiplicar la absorbancia morfolino por su constante determinada y por el factor de dilución para determinar la concentración en ng / l. La constante morfolino se calcula como: Morfolino constante = peso molecular de la absorbancia X morfolino 1000/molar. El peso molecular y coeficiente de absorción molar para el morfolino se puede encontrar en el &quot;Oligo Propiedades &quot;hoja proporcionada con el producto. Dividir la concentración morfolino, en ng / l, por el peso molecular para determinar la concentración en mM. Diluir el morfolino, si es necesario, a una concentración de trabajo, típicamente 1,2 mM. </li></ol> 2. Fin de amputación <ol><li> Anestesie pez cebra adulto en cualquiera tricaína o 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml en agua del tanque. </li><li> Amputar la aleta utilizando una cuchilla de escalpelo estéril u hoja de afeitar proximal a la primera punto lepidotrichial ramificación. Esto debe hacerse en la misma proximal / distal localización en cada animal (por ejemplo, 7 segmentos óseos distales de la cintura de la aleta). IMPORTANTE: asegúrese de cortar perfectamente perpendicular al plano anterior / posterior del animal. Los cortes en ángulo dará lugar a consecuencia de la aleta desigual de las mitades dorsal y ventral de la aleta. </li><li> Volver a los peces a un tanque. Por lo general mantener el pescado a 33 ° C para aumentar la tasa de regeneración. Dependiendo del diseño experimental, wait 0-2 días después de la amputación (dpa) para la regeneración de la aleta para comenzar antes de introducir el morfolino. Enfoques alternativos se discuten en la discusión, a continuación. </li></ol> 3. Morpholino inyección <ol><li> El día antes de inyectar el morfolino, hacer una placa de inyección (Figura 2). Asegúrese de cortar una muesca en un extremo del pozo, lo que ayuda a estabilizar el pescado para el procedimiento de microinyección. </li><li> A las 2 de dpa, preparar el aparato de inyección de micro-y la solución de morfolino. </li><li> Diluir el marcados con fluoresceína morfolino a la concentración adecuada (se recomienda a partir de 1,2 mM) y colóquelo en un baño María a 65 ° C el agua, durante 5 minutos. </li><li> Tire de la aguja de vidrio para la inyección de micro-utilizando un extractor de la aguja. </li><li> Coloque la aguja con el morfolino (nota: en función de si hace una copia de relleno o de carga frontal, la aguja se determinará si se carga la primera aguja, o cortar la punta de la primera). </li><li> Corte la punta de la aguja en unn ángulo. </li><li> Siga las instrucciones de su sistema de micro-inyección para inyectar una burbuja de aproximadamente el 5 nl de morfolino por inyección. Los mayores volúmenes de morfolino podría alterar el tejido. </li><li> Anestesiar el pescado y colóquelo en la placa de la inyección. Retire todo el exceso de líquido y orientar la aguja en el lugar apropiado, justo por debajo de la raya ósea (Figura 3). Utilizando un microscopio y un aparato apropiado para microinyección morfolino inyecciones (véase la Tabla de los reactivos específicos), inyectar el morfolino en la aleta de delante a atrás, como se muestra en la Figura 3. La inyección de atrás hacia delante hace que el tejido de la aleta para enrollar durante la inyección y es muy difícil. </li><li> Inserte la aguja suavemente en el tejido regenerativo, justo por debajo de cada rayo ósea (marcado &quot;1&quot; en la Figura 3) y empuje hacia distal hasta el situado en el blastema (&quot;2&quot; en la Figura 3). Tenga cuidado de no empujar la aguja a través de la en-aleta neumático. Cuando la aguja está correctamente localizado, inyectar el morfolino (es decir, haga clic una sola vez). De 1,2 mm, el marcados con fluoresceína morfolino solución aparece de color amarillo-verde, incluso en condiciones normales de luz. Con cada inyección, un amarillo &quot;bocanada&quot; de solución morfolino puede ser visualizado, que ayuda a localizar la inyección para el blastema. Aproximadamente el 75 nl (10-15 clics) de la solución de morfolino debe inyectarse por rayos ósea. Pausa ~ 1 segundo entre los clics. Sólo se inyectan en la cara dorsal, ventral, con la electroporación de sólo control. Alternativamente, se podría repetir este procedimiento entero usando un morfolino control en el medio ventral de la aleta. </li></ol> 4. La electroporación de los morfo- <ol><li> Inmediatamente después de la inyección de la morfolino, retirar la placa de inyección desde el aparato de inyección de micro-. Completa la placa de pozo de inyección con la solución de anestesia hasta que el pescado se sumerge. La electroporación se lleva a cabo bajo la línea de agua. </li> &lt;li&gt; Un platino 3 mm de diámetro de la placa de electrodo pinza (CUY 650-P3 pinzas, Protech Internacional) se localizan los pulsos a aproximadamente la mitad de la aleta. Tenga cuidado de no tocar los electrodos en el tejido de la aleta. Para asegurarse de que los electrodos no se tocan el tejido de la aleta, girar el pescado en su parte dorsal y mirar hacia abajo de la línea media de la electroporación. </li><li> Electroporar tanto la dorsal y ventral (para el control de algunos efectos no específicos de electroporación) lados de la aleta con una onda cuadrada CUY21 Electroporador (Protech International, Inc.). Limpie los electrodos con un KIMWIPE húmedo después de cada electroporación para eliminar las burbujas que puedan haberse formado. Si no se retiran, un mini-carga se acumula, lo que atraerá a los tejidos hacia el electrodo. Los parámetros de electroporación se debe establecer en diez impulsos consecutivos 50 mseg, a 15 V con una pausa de 1 seg entre impulsos. </li><li> Coloque el pescado sobre un portaobjetos de vidrio o placa de Petri y rápidamente la imagen de la aleta, asegurándose de que nover la orientación dorsal / ventral. Esta imagen se utiliza para el análisis recrecimiento en el día siguiente. Volver a los peces en el tanque. </li></ol> 5. Análisis <ol><li> Si la proteína blanco que fue derribado en la expresión es necesaria para la regeneración de la aleta adecuada, una gran diferencia entre las mitades dorsal y ventral de la aleta debe ser evidente un día después de la electroporación (Figura 5B). </li><li> A las 3 de dpa, tomar otra foto de la aleta de cada uno de los peces y hacer coincidir la imagen con la que corresponde la imagen 2 dpa (Figura 5B). La variación natural en el patrón de pigmentación de la aleta entre los animales le permitirá identificar correctamente a los peces. </li><li> Usando la imagen del NIH, trazar las zonas 2 y 3 dpa dpa de las dos mitades de los dorsales y ventrales (Figura 5b). </li><li> Para determinar el área% del uso de dorsal ventral versus la fórmula siguiente: (dorsales 3dPA - dorsales 2dpa) / (ventral 3dPA -<html> 2dpa ventral) X 100 =% de superficie </li></ol> 6. Los resultados representativos <ol><li> Siempre ensayo para la extensión de la aleta a las 3 hpe dpa, o 24 (horas después de la electroporación). En este momento, el morfolino marcados con fluoresceína debe estar presente en el medio dorsal de la aleta (Figura Suplementario 1 y Figura 6A). Es normal ver algunos trasero hasta el nivel de la amputación. </li><li> No debería haber ninguna diferencia entre las partes dorsal y ventral de la aleta inyectado y electroporación con los morfolinos de control (Figura 6B). </li><li> Si el grupo experimental morfolino dirige una proteína esencial para la extensión de la aleta, una gran diferencia entre las partes dorsal y ventral se observó (Figura 6C). </li><li> Si el electrodo tocado la aleta durante la electroporación, el tejido aparecerá marrón (casi quemado en apariencia) y necrótico. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema de los diferentes eventos que se producen durante la regeneración de la aleta. Los tiempos que subyacen en cada caso se dan en la hora posterior a la amputación (HPA) y corresponden a una temperatura del tanque de 33 ° C. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figura 2. A. Esquema de la placa de inyección, que está hecho de agarosa y contiene una pequeña bien para mantener el pescado durante la microinyección del morfolino. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema de microinyección morfolino. A. Coloque el pescado en el plato con la cabeza de los peces en la muesca del pozo, lo que ayudará a los peces se mantienen estables. B. A menor aumento, arreglar la aguja de modo que que está cerca de la regeneración de tejido de la aleta. C. </stro&gt; ng A mayor aumento, inyectar el distal a cada rayo de la aleta ósea (es decir, en cada uno de blastema) morfolino. La aguja debe entrar en el tejido distal al rayo ósea (1), y luego continuar a la ubicación de la blastema (2). Nota: los círculos verdes en el esquema sólo se pretende mostrar la ubicación de la inyección. El morfolino brevemente puede ser visualizado como una verde / amarillo &quot;bocanada&quot; después de cada inyección, sin embargo, esto no persiste como se muestra en el esquema. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema de la electroporación de la aleta. A. Tras la microinyección, coloque el pescado en una placa de Petri completa de la anestesia y electroporar tanto las mitades dorsal y ventral. B. Asegúrese de no tocar el tejido de la aleta. Los electrodos se colocan ~ 1 mm del tejido. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figura 5. Esquema de los métodos utilizados para calcular la inhibición de la aleta consecuencia. A. Tome una fotografía de la aleta de cada uno de los peces a las 2 de dpa, ya sea inmediatamente antes o después de la inyección morfolino y electroporación. Trace el tejido regenerativo, tanto de la dorsal (verde) y ventral (azul) mitades de la aleta con NIH Image, (líneas negras discontinuas). B. A las 3 de dpa, tomar otra fotografía de cada aleta y otra vez trazar las áreas dorsal y ventral de rebrote con NIH Image. C. Restar el área de nuevo crecimiento en dos DPA de la regeneración total en tres dpa, tanto para los que tienen dorsal y ventral. El porcentaje de área de dorsal ventral versus re-crecimiento se puede calcular usando la fórmula: ((D 3dPA - D dpa 2) / (V 3dPA - V 2dpa)) X 100. Porcentaje de inhibición = 100 - por ciento de área. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> Figura 6. Ejemplos de esperalos resultados. imagen A. fluorescente que muestra un marcados con fluoresceína de control morfolino en el medio dorsal de la aleta, 24 horas después de la electroporación (HPE). B. Brightfield imagen de una aleta que se inyectó y electroporación con un morfolino control en el medio dorsal . La imagen muestra el nuevo crecimiento igual de ambas las mitades dorsal y ventral de la aleta, de 24 años HPE. C. imagen de campo claro de una aleta que se inyecta y la electroporación con un morfolino experimental en la mitad dorsal. La imagen muestra la inhibición de la regeneración en el lado dorsal / inyectado. La línea muestra la cantidad de nuevo crecimiento en dos dpa, inmediatamente antes de la inyección morfolino y electroporación. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figura 7. Esquema de una inyección alterna y procedimiento de electroporación de proteínas diana implicados en la cicatrización de heridas y la formación del blastema. A. Inyecte el morfolinoentre cada radio de la aleta de hueso en la parte dorsal de la aleta. B. electroporar los morfo-como de costumbre. C. amputar la aleta inmediatamente proximal (~ 1 segmento óseo) en el sitio de la inyección. D. La marcados con fluoresceína morfolino se puede observar en el epitelio de la herida y la blastema a las 24 HPE. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figura 8. Utilizando la técnica para apuntar epitelio herida y la formación de blastema. A. imagen Brightfield de una aleta en 24 hPa que se inyectó y electroporación con un morfolino control inmediatamente antes de la amputación. Imagen B. fluorescente de la aleta se muestra en el panel A. Nota que el medio inyectado dorsal de la aleta muestra buena captación de la morfolino en el tejido regenerativo. C -. C &quot;aumento mayor de la mitad de la aleta dorsal muestran en los paneles A y B. Los puntos de inyección a menudo son todavía visibles (puntas de flecha), Pero muchas células diana han migrado a participar en el epitelio y la formación de la herida blastema (flecha). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Figura 9. Utilizando la técnica a células diana que migran para formar el blastema. A. fluorescente y las imágenes insertadas campo claro que muestran una aleta inyectado y electroporación con morfolino en ambas las mitades dorsal y ventral. La aleta fue amputada luego en dos planos. La mitad dorsal se cortó inmediatamente distal a los sitios de inyección, en tanto que la mitad ventral fue cortada 9-10 segmentos óseos distales a los sitios de inyección. B. A los 24 hPa, las imágenes en los recuadros fluorescentes y muestran que el campo claro morfolino ha migrado a la dorsal regenerar (1), pero no el regenerado ventral (2), lo que indica que sólo la celda inmediatamente proximal al sitio de corte participar en la formación de blastema. Los dos conjuntos de puntas de flechas blancas muestran el nivel de cada una amputaciónplano. Los paneles marcados 1 y 2 en el extremo derecho de la imagen muestran una vista mayor aumento de las mitades dorsal y ventral de la aleta, respectivamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Suplementario Figura 1.</a> Un video de un confocal z pila de una región correspondiente a la ubicación de un blastema en una aleta inyectado y electroporación con un morfolino de control. La imagen fue tomada a las 24 HPE. Puesto que una molécula de fluoresceína solo no puede ser visualizada, no todo el morfolino puede ser visualizado o cuantificado. Sin embargo, estas imágenes dan una idea de los diferentes grados de absorción que pueden ser visualizados en celdas individuales, a partir de puntos puntiformes, a células enteras llenas de fluorescentes morfolino. En la imagen fija, la orientación se muestra. Barra de escala: 25 micras.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

A continuación, describimos un poderoso pérdida de la función de acercamiento a las proteínas de derribo condicional de interés durante la regeneración de la aleta de pez cebra adulto. Esta técnica se ha utilizado para estudiar los genes de las uniones, la señalización de receptores, factores de transcripción, y microRNAs durante el crecimiento de la aleta de regeneración 16, 20-22. Se anticipa que esta técnica podría utilizarse también para estudiar los genes necesarios para la curación de heridas y la formación de blastema mediante la adaptación de la técnica. Por ejemplo, se inyecta y electroporación un morfolino control en el espacio entre los radios de las aletas óseas en el medio dorsal de la aleta antes de la amputación (Figura 7). A continuación, amputado la aleta inmediatamente distal al plano de la inyección. 24 hPa, se observó que las células morfolino-destinatarios habían migrado distalmente para formar tanto el epitelio herida y blastema (Figura 8), lo que indica que las células durante las primeras etapas de regeneración también se puede Targpuestó. La técnica tiene algunas limitaciones notables. Por ejemplo, la fluorescencia de la etiqueta fluoresceína no persiste posterior a la fijación y el procesamiento de inmunohistoquímica, lo que hace imposible para correlacionar un fenotipo particular celular (es decir, la proliferación de células) con la cantidad de morfolino presente en una célula. Además, hemos podido lograr consistentemente la electroporación de plásmidos en la aleta de la cola de regeneración, aunque un grupo anterior hizo reportar la electroporación con éxito de ADN en el tejido de la aleta 23. Por último, hemos observado que el morfolino sólo es efectiva durante aproximadamente 48 horas después de la electroporación 21, que prohíbe el uso de esta técnica en su forma actual para probar los genes implicados en la diferenciación de los tipos de células nuevas. Las pruebas adicionales y la modificación del procedimiento puede superar estas limitaciones actuales. Además, es posible que esta técnica podría ser usadapara probar proteínas implicadas en la migración de células del tejido subyacente a la blastema. Por ejemplo, se inyecta y electroporación un control morfolino en ambos lados de la aleta (como se describe en la Figura 7) antes de la amputación. A continuación, el amputado media dorsal de la aleta inmediatamente distal al plano de inyección y amputado la aleta ventral mucho más distalmente. A los 24 hPa, las células morfolino-positivos en el lado dorsal habían emigrado desde el sitio de la inyección en el epitelio que recubre la herida y la blastema. Sin embargo, que no era el caso en el lado ventral (Figura 9). Esto apoya la idea de que sólo las células que son la base del plano de la amputación participar en la respuesta regenerativa. Estos datos también sugieren que las proteínas de la hipótesis de que se requiere para la migración celular podría ponerse a prueba utilizando esta técnica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT o CUY21-SC de onda cuadrada electroporador </td><td> Protech Internacional </td><td> CUY21EDIT o CUY21SC </td><td> Ambas unidades funcionan para este protocolo </td></tr><tr><td> De 3 mm de diámetro electrodos de paletas </td><td> Protech Internacional </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino se diseñan a medida para su proteína de interés </td></tr><tr><td> 2-fenoxietanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesia, diluido 1:1000 en los peces de agua sistema para el procedimiento, 1:500 para la eutanasia </td></tr><tr><td> Micro-Injectien la bomba </td><td> World Precision Instruments </td><td> PV830 neumático PicoPump </td><td> Muchos sistemas de microinyección diferentes podrían ser utilizados </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> World Precision Instruments </td><td> MMJR </td><td> Diestro (MMJL para zurdos) </td></tr><tr><td> Micro-inyección agujas, 1,0 mm de diámetro exterior </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> Se trata de vidrio de borosilicato capilares, tirado en una aguja </td></tr><tr><td> Portaagujas </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5430-ALL </td><td> Kit de Pico boquilla, asegúrese de que la inserción de la pipeta de 1,0 mm de junta </td></tr><tr><td> Aguja extractor </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Otros micropipeta / aguja extractores también se debe trabajar </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Número varía dependiendo del fabricante </td><td> Cualquier microscopio estereoscópico con 20X óptico y la capacidad de trabajar con micromanipulador </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Ciertas especies de urodelos y peces teleósteos pueden regenerar sus tejidos. Zebrafish se han convertido en un modelo ampliamente utilizado para estudiar la regeneración espontánea de los tejidos adultos, tales como el corazón 1, 2 retina, la médula espinal 3, el nervio óptico 4, las células sensoriales del cabello 5, 6 y las aletas. La aleta de pez cebra es un apéndice relativamente simple que es fácil de manipular para el estudio de múltiples etapas en la regeneración epimorfica. Clásicamente, la regeneración de la aleta se caracteriza por tres fases distintas: la curación de heridas, la formación del blastema, y ​​la consecuencia de la aleta. Después de amputar parte de la aleta, el epitelio que rodea prolifera y migra sobre la herida. A los 33 ° C, este proceso ocurre dentro de seis horas después de la amputación (HPA, Figura 1B) 6,7. A continuación, las células subyacentes de los diferentes linajes (por ejemplo los huesos, la sangre, células gliales, fibroblastos) vuelva a entrar en el ciclo celular para formar una proliferativa blastema, wientras la epidermis suprayacente continúa a proliferar (Figura 1D) 8. Se produce como consecuencia de las células proximales del blastema volver a diferenciarse en sus respectivos linajes para formar nuevo tejido (Figura 1 E) 8. Dependiendo del nivel de la amputación, la regeneración completa se completa en una semana a un mes. La expresión de un gran número de familias de genes, incluyendo genes Hox Wnt, FGF, MSX, el ácido retinoico, shh, de primera clase, bmp y activina-beta genes A, está regulado en etapas específicas de la aleta de la regeneración de 9-16. Sin embargo, las funciones de estos genes y sus proteínas codificadas durante la regeneración han sido difíciles de evaluar, a menos que un inhibidor específico de la proteína existe 13, un mutante sensible a la temperatura existe o un animal transgénico (ya sea que sobreexpresan la proteína de tipo salvaje o una dominante -negativo proteína) se generó 7,12. Hemos desaped una técnica de genética inversa para probar rápida y fácilmente la función de cualquier gen durante la regeneración de la aleta. Oligonucleótidos Morpholino son ampliamente utilizados para estudiar la pérdida de proteínas específicas en el pez cebra, Xenopus, pollo, y el desarrollo del ratón 17-19. Morpholinos pares de bases con una secuencia de ARN complementaria a cualquiera de los bloques de pre-ARNm de empalme o traducción del mRNA. Se describe un método para introducir de manera eficiente marcados con fluoresceína antisentido morfolinos en la regeneración de las aletas de pez cebra a la expresión de caída de la proteína diana. El morfolino se micro-inyectada en cada uno de blastema de regeneración de la aleta del pez cebra cola y electroporación en las células circundantes. Fluoresceína ofrece el cargo a la electroporar morfolino y para visualizar el morfolino en el tejido de la aleta. Este protocolo permite la precipitación de proteínas condicional para examinar el papel de proteínas específicas durante el crecimiento de la aleta regenerativa. En el Discussion, se describe cómo este enfoque puede ser adaptado para estudiar el papel de las proteínas específicas durante la curación de heridas o la formación de blastema, así como un marcador potencial de migración de las células durante la formación del blastema.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Se describe un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína diana durante la regeneración de la aleta del pez cebra adulto. Esta técnica implica la inyección de micro y electroporación morfolinos antisentido de oligonucleótidos en el tejido de la aleta, que permite probar el papel de la proteína en varias etapas de regeneración de la aleta, incluyendo la curación de heridas, la formación blastema, y ​​consecuencia regenerativa.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

in-vivo-electroporation-morpholinos-into-regenerating-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.8K vistas.  University of Notre Dame. Se describe un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína diana durante la regeneración de la aleta del pez cebra adulto. Esta técnica implica la inyección de micro y electroporación morfolinos antisentido de oligonucleótidos en el tejido de la aleta, que permite probar el papel de la proteína en varias etapas de regeneración de la aleta, incluyendo la curación de heridas, la formación blastema, y ​​consecuencia regenerativa.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...