Los autores desean agradecer a los Freimann Life Science Center y el Centro de Investigación para el personal de pez cebra para su cuidado y mantenimiento del pez cebra.

1. Morfolino preparación: <ol><li> Todos los oligos morfolinos deben ser diseñados y ordenados a través de GeneTools (Philomath, OR). Utilizamos la carga positiva lisamina etiquetados morfolinos para conducir los morfolinos electroporated hacia el electrodo negativo. Hemos intentado, sin éxito, objetivo con carga negativa con fluoresceína etiquetados morfolinos para el electrodo positivo con esta técnica. Diluir 300 nmol de morfolino en 100 l de agua libre de nucleasa para obtener una solución 3 mM. Alícuota del morfolino en varios tubos de microcentrífuga sellada en parafina. Almacene lejos de la luz a temperatura ambiente. </li><li> Determinar la concentración morfolino mediante la dilución de 5 l de morfolino (o agua para diluir el morfolinos como un espacio en blanco) en 95 l de HCl 0,1 N. La longitud de onda del espectrofotómetro (λ) a 265 nm. Calcular la constante de su morfolino mediante la siguiente ecuación: Constante = peso molecular en particular a su morfolino X 1000/molar absorbancia. </li><li> Va a encontrar el peso molecular y los datos de absorbancia molar de la &quot;Oligo Propiedades&quot; que acompañan a cada hoja de morfolino. Analizar el espacio en blanco para verificar las lecturas de referencia y tomar las lecturas de cada diluida morfolino. Multiplicar la absorbancia a 265 nm de cada morfolino por su constante y determinada por el factor de dilución para obtener la concentración en ng / ul. Divida este número por el peso molecular para determinar la concentración en mM. Diluir el morfolino, si es necesario, a una concentración de trabajo. </li></ol> 2. Eliminar la capa de la córnea exterior: <ol><li> 6-12 meses anestesiar pez cebra adulto mayor en tricaína o 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml en el tanque de agua de pez cebra. </li><li> Envuelva el pez cebra en un húmedo pedazo de toalla de papel, que cubre las branquias, pero dejando el ojo expuesto. El pescado envuelto se coloca bajo un estereoscopio y la ampliación se incrementa hasta que el diámetro del ojo se llena aproximadamente un tercio deel campo visual (Figura 1). </li><li> Utilizando Dumont # 5 pinzas, agarre la córnea exterior cerca de la fisura óptica. Este tejido es de color rojo y está etiquetada como &quot;OC&quot; en la Figura 1. Hay una que sobresale del labio o de la flecha marcada &quot;CL&quot;. Tirar a un ángulo bajo (es decir, 10 grados) a través del ojo para eliminar la córnea exterior. Con la práctica, esto se puede completar en un solo movimiento. Si la hoja de pinzas, volver a agarrar el pañuelo y tirar de nuevo en un ángulo bajo hasta que sea removido. Una córnea muy unido puede causar que el ojo se desprendió de la toma cuando se tira. Usted puede mantener los ojos se conviertan en desplazadas por estabilizarse con otro conjunto de pinzas. </li></ol> 3. Incisión en la córnea y la inyección de morfolino: <ol><li> Inmediatamente después de la eliminación de la córnea exterior, hacer una pequeña incisión en la córnea, donde el alumno cumple con los iris (Figura 2). Esto se hace usando un zafiro hoja de bisturí (ver Materiales). </li><li> Carga 0,5 l de la solución 3.0 mM morfolino en un Hamilten jeringa equipada con un medidor de 33 extraíble, romo extremo de la aguja (ver Materiales). Pipeta de arriba y abajo para eliminar las burbujas de aire en la línea. Con cuidado, inserte la aguja en el humor vítreo a través de la incisión (Figura 2). No inserte la aguja demasiado lejos o que se perfore la retina o desplazar la lente. </li><li> Inyecte lentamente la solución morfolino en el espacio vítreo. Dependiendo de la edad de los peces, el espacio vítreo celebrará ~ 0,5 l. Usted debe visualizar vítreo incoloro se escape de la incisión, ya que es desplazada por la solución morfolino. Inyectar hasta una pequeña cantidad de fugas de solución morfolino fuera de la incisión. Que claramente debe visualizar el lisamina etiquetados con morfolino dentro del ojo. </li><li> Después de la inyección, el retorno a los peces en el tanque de recuperación. Por lo general, sólo se inyectan en el ojo izquierdo, con el ojo derecho como un control no inyectadas, pero la electroporación de los dos ojos es posible. </li></ol> 4. Electroporación: <ol><li> Siguientela inyección de aproximadamente 10 peces, volver a anestesiar a los peces una inyección y lo envuelve en un pedazo de toalla de papel humedecida, apenas cubriendo las branquias, pero dejando el ojo expuesto. La transferencia de los peces a una placa de Petri. Póngase guantes de látex o similares para evitar la exposición a la anestesia. Mientras que suavemente la celebración de los peces en el fondo del plato, llenar el recipiente con la anestesia (Figura 3, panel izquierdo). </li><li> Un electrodo de platino de 3 mm de diámetro de la placa (ver Materiales) se localiza en los pulsos de electroporación de aproximadamente la mitad de la retina. Por lo general blanco de la retina dorsal. Presione suavemente el electrodo positivo a la baja en la mitad ventral del ojo. Con la córnea exterior removida, el ojo es fácil de girar, dejando al descubierto la parte dorsal del globo ocular. </li><li> Mientras sigue presionando hacia abajo en la parte ventral del ojo, colocar el electrodo negativo cercano (~ 1 - 2 mm) de la media expuesta dorsal del ojo. Tenga cuidado de no tocar el electrodo negativo directamente a los ojos, lo que resultará en dañosla retina dorsal. Una vez que determine la distancia adecuada entre los electrodos, utilice el tornillo de ajuste en el mango de los electrodos para mantener que se propagan cuando electroporating. Esto evita que el electrodo negativo una distancia óptima del globo ocular cuando el electrodo positivo se presiona hacia abajo en su posición. </li><li> Electroporar del ojo usando una Electroporador CUY21 de onda cuadrada (ver Materiales). Los parámetros de electroporación se debe establecer en dos períodos consecutivos de 50-ms pulsos, a los 75 V, con una pausa de 1 segundo entre los pulsos. </li><li> Volver a los peces del tanque. Por lo general comienzan el protocolo para la constante de luz inducida por la degeneración de la retina inmediatamente después de la electroporación. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <ol><li> Durante 3-5 días después de la electroporación (dependiendo de la estabilidad de la morfolino), la etiqueta lisamina se puede visualizar en todas las capas de la retina en la retina seccionado (Figura 4). Esto sirve como una confirmación de la presencia dela etiqueta morfolino. </li><li> Podemos lograr caída proteína completa hasta 3-5 días después de la electroporación, dependiendo de la eficacia de la morpholino (Figura 5). Por lo general, durante los estudios de tratamiento con luz, cosechamos los ojos a las 3 o 4 días después de la electroporación morfolino. Esto se hace mediante la eliminación de todo el ojo con unas pinzas Dumont # 5B con extremos curvos (Figura 6; Materiales) y procesamiento de los tejidos por inmunohistoquímica 15. Al igual que con cualquier otra técnica de derribo, una demostración de caída eficiente debe ser demostrado con el fin de validar el fenotipo. Por lo tanto, se sugiere la obtención de antisueros para la proteína de interés. Alternativamente, si el anticuerpo no está disponible y el morfolino está dirigido a cualquiera de los aceptor de empalme o zona del donador en el pre-ARNm, se bloqueará el empalme eficiente de los ARNm. En este caso, es posible el uso de la transcriptasa inversa-PCR para amplificar las secuencias de acompañamiento en el ARN morphant y determinar la eficacia de bloquear el splic normalespatrón de ing. </li><li> Cuando la retina se seccionan desde nasal a temporal en el eje ventral dorsal, las casillas sombreadas azul (Figura 6) representan las áreas de la retina que son a menudo dañados por el evento en sí electroporación. La caja de color rosa sombreada representa el área que se presentará la morfolino en células de la retina por la electroporación. </li></ol><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que representa la eliminación de las capas epiteliales de la córnea. El panel izquierdo muestra las principales características estructurales del ojo, incluyendo la lente (L), el humor vítreo (Vit), la retina (R), la córnea exterior (CO), la córnea interna (IC), y la protrusión de la córnea ( CL). La orientación del ojo se muestra en la parte inferior derecha de la primera placa y la etiqueta es anterior (A), posterior (P), dorsal (D) y ventral (V). El color rojo indica la córnea externa que se retira. La segunda bandeja<html> El demuestra cómo las pinzas se utilizan para captar la protrusión corneal y para tirar de la córnea exterior a través de los ojos en un ángulo bajo (tercer panel). El panel derecho muestra cómo un segundo par de pinzas se pueden utilizar para estabilizar el ojo mientras tira de la córnea. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de los pasos involucrados en la inyección intravítrea de morfolino. Una pequeña incisión en el ojo donde el alumno cumple con los iris (panel izquierdo). La diferencia resultante debe ser lo suficientemente grande para una aguja de calibre 33, que se llena con la solución de morfolino, que se insertará (panel central). Inyecte lentamente 0,5 l de solución en el humor vítreo (panel derecho). Usted debe visualizar una pequeña cantidad de solución vítrea salir de la incisión en el humor vítreo está parcialmente sustituida por con-lisamina etiquetados morfolino (panel derecho). ig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Esquema del procedimiento de electroporación en general. El pez anestesiado, que se inyecta por vía intravítrea con el morfolino, se envolvió en una toalla de papel húmeda (panel izquierdo). La toalla de papel debe cubrir las branquias, pero no obstruir la vista (panel central). Presione suavemente el electrodo positivo hacia abajo en la parte ventral del ojo, permitiendo que la mitad dorsal del ojo a girar fuera de la cuenca. Colocar el electrodo negativo de aproximadamente 1 mm de la media dorsal de los ojos y comenzar la electroporación (panel derecho). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figura 4. Imagen confocal comparar una retina electroporated intravítrea sin la inyección de un morfolino lisamina-etiquetados (A), y en la retina una inyección intravítrea y electroporación con el morfolino lisamina-etiquetados (B). La etiqueta lisamina se encuentra en todas las capas de la retina y los tipos de células. ROS, barra exteriorsegmentos, ONL, la capa nuclear externa, capa de INL, nuclear interna, GCL, capa de células ganglionares. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figura 5. Confocal de imágenes comparando inmunolocalización PCNA en las retinas de electroporación con un morfolino control (panel izquierdo) y las retinas de electroporación con un morfolino anti-PCNA (paneles de la derecha) antes de la luz de la muerte inducida por las células fotorreceptoras. Adaptada a la oscuridad pez cebra adultos albinos fueron colocados en una luz intensa constante por 1, 2, ó 3 días después de la electroporación de la morfolino. El control de morfolino no reprimir la expresión de PCNA aumento en las retinas dañadas por la luz. El morfolino anti-PCNA eficiente derribaron la expresión de PCNA proteínas a través de tres días de daño constante de luz intensa. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Figura 6. Esquema (izquierda) muestra la enucleación del ojo para pLABORACIÓN y muestras criostáticas, que se realiza a lo largo del eje dorsal ventral. La caja de color rosa con sombra (derecha) muestra la región de la retina con la mayor cantidad de caída de proteínas utilizando esta técnica. Las casillas sombreadas azules representan áreas que son más a menudo dañados por el caso de la electroporación. La orientación del ojo tiene la etiqueta anterior (A), posterior (P), dorsal (D) y ventral (V).

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No tenemos nada que revelar

Recientemente, dos análisis de microarrays examinado los cambios de expresión génica que se produjeron durante la regeneración de la retina, ya sea de luz dañados o un parche quirúrgicamente extirpada la retina 10, 16. Ambos estudios revelaron que numerosos genes mostraron cambios significativos en la expresión, ya sea aumentando o disminuyendo, es probable que se requieren para los diferentes eventos que se producen durante la regeneración de la retina, como la re-entrada de la células de Müller en el ciclo celular, continuó la proliferación y migración de la progenitores neuronales de la capa dañada la retina, y la diferenciación de las células progenitoras neuronales en el tipo de célula neuronal correcto. Mientras que una comparación directa de estos dos conjuntos de datos de microarrays revelan genes candidatos que pueden estar implicados en estos procesos celulares, en última instancia, estos genes y sus proteínas codificadas deben ser probados para determinar si son necesarias para la regeneración neuronal. A continuación, describimos un poderoso pérdida de la función de enfoque de la conditioFinalmente las proteínas caída de interés en la retina del pez cebra adulto. Esta técnica se ha utilizado para estudiar tanto las proteínas extracelulares e intracelulares, así como moléculas de señalización, factores de transcripción y las proteínas necesarias para la replicación del ADN 17-19. Por lo tanto, este método ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración de la retina adulta de pez cebra. Hemos probado varios parámetros de electroporación (voltaje, el número de pulsos, el tiempo entre los pulsos) antes de un protocolo de éxito se logró. Un informe anterior de electroporating morfolinos en la regeneración de la aleta caudal del pez cebra utiliza 10 pulsos a baja tensión (15 V) 20. Debido a que la retina del pez cebra adulto está rodeado por varias capas de células y no es fácilmente accesible a los electrodos de pinza, los parámetros utilizados en la aleta no tuvieron éxito en la eficiencia electroporating morfolinos en la retina adulta. Por el contrario, un alto voltaje (100 V) a menudo resulted en la muerte de los peces. Recientemente, cinco pulsos de 80 V se describe a electroporar plásmido de ADN en la retina del ratón recién nacido cachorro 21. Se encontró que un poco menos intensa dos pulsos de 75 V como resultado de la electroporación con éxito de los morfolinos en la retina del pez cebra adulto con una supervivencia del 100% de los peces tratados. Además, hemos descubierto que la eliminación de la mayoría de los exteriores (o externo-la mayoría de) los componentes de la córnea aumentado considerablemente la eficiencia de la electroporación. Aumentar el número de pulsos pueden eliminar la necesidad de la eliminación de este tejido, pero también puede causar mayor daño a los tejidos. Los numerosos estudios demostraron que el control de estos parámetros no causó la muerte de importantes células de la retina o alterar las respuestas celulares específicos observados durante la regeneración de los fotorreceptores 19. Ganancia de función de los estudios no son posible en la actualidad con esta técnica in vivo, debido a nuestra incapacidad para electroporar constantemente grandes ácidos ribonucleico en todos los retinal células. Sin embargo, el éxito de electroporating plásmidos en la retina del ratón in vivo y la retina del pez cebra en los explantes sugiere que sigue siendo una posibilidad en el pez cebra 21, 22. Una de las ventajas de esta técnica es la electroporación aparece para introducir de manera eficiente la morfolino en todos los tipos de células de la retina diferente. Sin embargo, una debilidad potencial es que la electroporación de manera eficiente la entrega morfolino en sólo las regiones dorsal y la retina central. Un evento de electroporación segundo hacia la mitad ventral de la retina ocasiona la focalización adecuada a todas las capas, pero a menudo resulta en daños. Esta restricción espacial probablemente se debió a la forma y la colocación de los electrodos. El uso de electrodos especialmente diseñados con forma de copa que se podrían colocar alrededor de los ojos puede mejorar esta debilidad. Esta restricción espacial de la entrega morfolino limita el uso de esta técnica y se opone a la utilización de un éxito del ensayoh como el análisis de ERG que requieren una evaluación global de la retina. Cabe señalar que al igual que con cualquier experimento morfolino, es recomendable confirmar los resultados con un segundo, que no se superponen morfolino a la meta del mRNA. En algunos casos, es posible electroporar también dos diferentes al mismo tiempo morfolinos para derribar la expresión de dos proteínas diferentes. Hemos demostrado esto por derribar la expresión tanto de la pax6a y proteínas Pax6b, individualmente y en combinación 18. A pesar de que demostró el uso de esta técnica con nuestro modelo de daño de la luz, es probable que se podría utilizar para estudiar la regeneración en los modelos de otros daños o 2-8 para examinar la función de las proteínas de la retina en buen estado. Por ejemplo, la electroporación de morfolinos podría ser utilizado para derribar la expresión de canales específicos o moléculas de transducción de señales en el ganglio o células amacrinas y luego estudiar la función de estas señalesvías en el procesamiento visual. Sin embargo, como morfolinos sólo afectan a la traducción de la nueva proteína, uno tendría que esperar hasta el recambio de proteínas endógenas se produce antes de un ensayo se pudo realizar. Dependiendo de la estabilidad de la proteína, que puede durar desde unas horas a 18 días.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT o CUY21-SC de onda cuadrada electroporador </td><td> Protech Internacional </td><td> CUY21EDIT o CUY21SC </td><td> Tanto las unidades de trabajo para este protocolo </td></tr><tr><td> 3 mm de diámetro de electrodos de paleta </td><td> Protech Internacional </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino debe ser diseñado a medida para la proteína de interés </td></tr><tr><td> 2-fenoxietanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesia diluida 1:1000 en los peces de agua del sistema de procedimiento, 1:500 para la eutanasia </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinzas </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td>14095 </td><td> Cualquier # 5 pinzas con el trabajo </td></tr><tr><td> Dumont # 5B pinzas con puntas en ángulo </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 500234 </td><td> Se utiliza para la eutanasia después de enucleación del ojo </td></tr><tr><td> Zafiro hoja, lanza de doble filo, 1 mm de ancho, con mango de un cuchillo de zafiro </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> Hoja: 500314 Mango: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton jeringa con extraíble 33 calibre romo extremo de la aguja </td><td> Hamilton empresa </td><td> Jeringa: 87930 Aguja: 7762-06 </td><td> Se retira la aguja que viene con la jeringa y vuelva a colocar con 33 de calibre romo extremo de la aguja </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Muchos devastadora enfermedad ocular hereditaria a la ceguera progresiva e irreversible, porque los humanos no pueden regenerarse morir o enfermas neuronas de la retina. Por el contrario, la retina del pez cebra adulto posee la capacidad resistente de regeneración espontánea neuronal cualquier clase que se pierde en una variedad de diferentes modelos de daño en la retina, incluyendo la punción la retina, la ablación química, la temperatura alta concentración, y el tratamiento de luz intensa 1-8. Nuestro laboratorio ampliamente caracterizado la regeneración de los fotorreceptores después del tratamiento con luz intensa y constante interior neuronas de la retina después de la inyección intravítrea ouabaína 2, 5, 9. En todos los casos, residente de las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular para producir células progenitoras neuronales, que siguen proliferando y migran a la capa adecuada de retina, donde se diferencian en las neuronas deficientes. Nos caracteriza cinco etapas diferentes durante la regeneración de la dama de luzretina de GED que se destacaron por respuestas celulares específicas. Hemos identificado varios genes expresados ​​diferencialmente en cada etapa de la regeneración de la retina mediante el análisis de microarrays de ARNm 10. Muchos de estos genes son también críticos para el desarrollo ocular. Para probar la función de cada gen candidato / proteína en la regeneración de la retina, que es necesario desarrollar un método para limitar condicionalmente la expresión de una proteína única candidata a veces durante la regeneración de la retina adulta. Oligos morfolinos son ampliamente utilizados para estudiar la pérdida de la función de proteínas específicas durante el desarrollo del pez cebra, Xenopus, pollo, ratón, y 11-14 en xenoinjertos de tumores humanos. Estos pares de bases modificadas con oligonucleótidos complementarios de secuencias de ARN para bloquear tanto el empalme o traducción del ARN diana. Morfolinos son estables en la célula y puede eliminar o &quot;caída&quot; expresión de la proteína de tres a cinco días 12. En este caso,se describe un método eficiente para la expresión de proteínas caída de destino en la retina del pez cebra adulto. Este método emplea lisamina etiquetados con morfolinos antisentido que se inyectan en el vítreo del ojo de pez cebra adulto. Con unas pinzas electrodo, el morfolino entonces electroporated en todos los tipos de células de la retina dorsal y central. Lisamina proporciona la carga en el morfolino para la electroporación y pueden ser visualizadas para determinar la presencia de la morfolino en las células de la retina. Caída condicional en la retina se puede utilizar para examinar el papel de proteínas específicas en diferentes momentos durante la regeneración. Además, este enfoque puede ser utilizado para estudiar el papel de proteínas específicas en la retina en buen estado, en procesos como la transducción visual y el procesamiento visual en las neuronas de segundo orden.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

in-vivo-electroporation-of-morpholinos-into-the-adult-zebrafish-retina

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.1K vistas.  Wayne State University School of Medicine. Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

Video: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Cultura organotípicos de retina de un conejo adulto

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Investigación

Biología

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporación de micobacterias

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...