Damos las gracias a los miembros del Alto laboratorio útil para los debates. También agradecemos a El Fondo para Imagen Molecular y Celular de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, específicamente el Dr. Chris Gilpin, Januszewski Tom, y Mueller Laurie por su experiencia técnica y asesoramiento. También agradecemos al Dr. Dong Xionan para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención AI083359 a NMA

1. Cultivo de células mamíferas <ol><li> Riñón de rata normal (NRK), inmortalizada cáncer de cuello uterino (HeLa), u otras líneas celulares de mamífero adecuadas se cultivan a 37 ° C, 5% de CO 2, en cubreobjetos de vidrio fotograbados reticulados fijados a vivir platos de células (véase la Tabla 1 para cualquier reactivo o aparato usado en este protocolo) en DMEM + 10% de FBS y 1% Pen / Strep. Se deben tomar precauciones para mantener un ambiente estéril cuando se trabaja con células de mamífero cultivadas. </li><li> Dependiendo de su experimental línea de tiempo (0-5 horas vs 1-2 días después de la inyección) la confluencia de las células debe ser ajustado a ~ 50% o ~ 25%, respectivamente. </li></ol> 2. Microinyección <ol><li> Preparar proteína deseada, ADN o moléculas pequeñas en su elección de tampón, en función de su susceptibilidad a la cultura celular, a un volumen final de ~ 50 l. Inertes tintes fluorescentes como Texas Red o Blue Cascadese incluyen con el fin de marcar las células microinyectados; elección del colorante de inyección y la sonda fluorescente debe tener excitación que no se solapan y longitudes de onda de emisión. La concentración de la molécula de interés necesaria para la microinyección deben ser determinadas empíricamente, y los colorantes fluorescentes de rastreo se utilizan comúnmente en 0.5-1.0 mg / ml. Típicamente, la rodamina o fluoróforo otro se une covalentemente a la molécula de interés utilizando un kit comercial, sin embargo, otros métodos de detección pueden ser utilizados dependiendo de la sensibilidad. Para obtener más información, vea Consideraciones de Críticos de abajo. </li><li> Filtrar la inyectante (~ 50 l) a través de un filtro de 0,22 micras centrífuga. Filtros centrífugos son preferibles a vacío y / o filtración de jeringa que se han asociado volúmenes muertos. </li><li> Para generar la aguja de microinyección, pipetas de vidrio de borosilicato se extraen usando una micropipeta Brown Flaming-Puller directrices siguientes fabricantes. Alternativamente, la microinyecciónagujas se pueden comprar de proveedores como Eppendorf que hace Femtotip agujas de microinyección. </li><li> Con cuidado, pipetear 4 l de inyectado en el extremo de la aguja sin ser molestados con microinyección Eppendorf 20 Femtotips. Asegúrese de que no hay burbujas en la aguja de microinyección tiró. Cargar aguja de microinyección en el brazo de la micromanipulador Eppendorf InjectMan FemptoJet unido a un microscopio invertido. Para una buena revisión del procedimiento de microinyección, el lector es dirigido a una revista anterior del artículo experimentos visualizados 8. </li><li> Colocar plato de células vivas con cubreobjetos reticulados y de células cultivadas en el soporte de plato del microscopio invertido Zeiss. Encontrar las células que crecen dentro de una cuadrícula fotoincisa y anotar el identificador alfanumérico de rejillas, este se utilizará en todas las etapas posteriores. Idealmente, localizar las células en el centro del cubreobjetos como las medidas subsiguientes, limitar la transferencia de la muestra en los bordes del cubreobjetos. </li><li> Inyección manualmente el brazo inferior en su lugar sobre el cubreobjetos, y el uso de la palanca de mando micromanipulador y controles, inferior aguja de inyección hacia abajo hasta que la punta toca suavemente la superficie de las células cultivadas y Límite de prensa &#39;para evitar el movimiento de la aguja más allá de este punto y rompiendo así el frágil sacó de vidrio de borosilicato. Todos los demás aspectos de la microinyección de células se realizan como por Eppendorf manual de usuario FemtoJet InjectMan. La técnica de microinyección fue utilizado recientemente para entender individuales secretadas proteínas de virulencia de las bacterias 9. </li><li> Microinyectar cualquier otra célula dentro de la red elegida. Con las células cultivadas a ~ 50% de confluencia, se puede esperar ~ 80 células por 600 micras 2 rejilla (ejemplo mostrado en la fig. 3A). Por lo tanto, después de una inspección microscopía de fluorescencia y electrónica, habrá un n de ~ 30-40 experimental y control de las células. </li><li> Coloque en vivo de células de mamífero plato de nuevo en cultivo celular incubadora para deseadotiempo según lo dictado por la configuración experimental. Alternativamente, se puede proceder directamente de microinyección para el análisis por microscopía de lapso de tiempo para esperar la aparición de determinadas estructuras subcelulares de interés antes de la fijación. </li></ol> 3. Microscopía de fluorescencia <ol><li> Si se desea, realizar vivo de células con lapso de tiempo mediciones de fluorescencia de células microinyectados, después de lo cual, reemplazar el medio con 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M tampón de cacodilato (pH 7,4) y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Sin embargo, si las mediciones de células vivas no son necesarios, descartar los medios de crecimiento celular y fijar las células con 5 ml de formaldehído 3,7% en 1xPBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche fijador y reemplace con 5 ml 1xPBS, vaya al paso 3.2. Nota: es muy importante no añadir glutaraldehído hasta después de microscopía de fluorescencia se ha completado. </li><li> Colocar el plato de célula viva con cubreobjetos fotoincisa cuadriculada en un microscopio de fluorescencia (confocal no se requiere para thipaso s) y recoger campo 5-10 brillante y las imágenes fluorescentes de la rejilla apropiada para documentar la disposición de las células (Fig. 4A). Identificar las células que han sido microinyectados utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión del colorante inerte inyección (Fig. 4B). Es importante para obtener imágenes a diferentes aumentos (por ejemplo, 10x y 65x) con el fin de facilitar la identificación de células microinyectados en los pasos posteriores que implican microscopía electrónica. </li><li> Utilizando un microscopio de fluorescencia confocal, se recoge una pila Z de células microinyectados dentro de la cuadrícula identificado en el paso por encima de 2,5. Gran aumento (100x) que se necesita con el fin de correlacionar las imágenes fluorescentes con estructuras subcelulares que serán identificados en microscopía electrónica. </li><li> Los cubreobjetos se retiran del fondo de las placas de células vivas con cubreobjetos líquido eliminación comercialmente disponible y se coloca la celda hacia arriba en un plato de cultivo celular que contiene 5 ml virgen1xPBS. El cubreobjetos se procesa entonces para microscopía electrónica como se detalla a continuación. </li></ol> 4. Microscopía electrónica de transmisión <ol><li> Reemplazar tampón 1xPBS con 2 ml de glutaraldehído 2,5% en tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,4) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Más tiempo de incubación, aunque no es necesario, ayudará en el mantenimiento de las estructuras subcelulares. Nota: formaldehído por sí sola no es suficiente para un fijador EM análisis. </li><li> Eliminar las células fijador y se mancha con la adición de 2 ml de tetróxido de osmio al 1% en tampón cacodilato 0,1 M durante 30 min seguido por tres lavados con tampón de cacodilato y finalmente sustituir el tampón con ddH 2 O. </li><li> Siguiendo los protocolos estándar de EM, deshidratar la muestra en un gradiente (70% a 100%) series de etanol. Preparar resina Epon y cubreobjetos lugar de células hacia abajo sobre la parte superior de una resina Epon tubo lleno. Permitir la polimerización durante 24 horas a 60 ° C. Al colocar el cubreobjetos fotograbados cuadriculada celda del lado hacerwn sobre la resina Epon, tanto las células de interés, así como el patrón de rejilla se transfiere a la resina Epon durante la polimerización (ejemplo mostrado en la fig. 3B). </li><li> Retire cubreobjetos de resina Epon rápidamente por inmersión en nitrógeno líquido y / o agua hirviendo. Inspeccione la superficie de la resina en un ámbito de disección binocular para localizar la red de interés (nota: el golpeteo de la red se transferirá como una imagen de espejo). Utilizando una cuchilla de afeitar estéril o bisturí, corte del bloque de Epon hacia abajo de tal manera que sólo la red de interés está en el vértice del bloque de resina Epon. </li><li> Uso de un ultramicrotomo, adquirir las secciones de serie del bloque recortan en el espesor deseado (~ 70 nm de espesor para TEM convencional y ~ 250 nm de espesor para tomográfica TEM). Contraste las secciones con acetato de uranilo y citrato de plomo siguiendo los protocolos estándar. </li></ol> 5. Luz correlativa y Microscopía Electrónica <ol><li> Reubicar las células de interés enel microscopio electrónico utilizando imágenes obtenidas en los pasos anteriores. Una vez que las células microinyectados de interés se han situado, utilice las imágenes de alta resolución confocal de fluorescencia para identificar las regiones dentro de la célula que son de interés. Imagen de éstos en alta resolución utilizando TEM. Usar puntos de referencia tales como la periferia de la célula y la envoltura nuclear para determinar qué fluorescente z-pila imagen corresponde a la EM rebanada. </li><li> Utilizando el programa de imágenes de su elección (por ejemplo, la imagen J, Adobe Photoshop, etc), reducir la opacidad de la imagen fluorescente al 50% y se superpone sobre la imagen TEM con las que se relaciona. Alinear las imágenes mediante el ajuste de la escala (recordar para restringir las proporciones) y la rotación de la imagen confocal para que coincida con la imagen de MET. Ajustes precisos de contraste, nitidez, etc en la imagen fluorescente puede ayudar en la alineación. Nota: se ha encontrado que la heterocromatina, la envoltura nuclear, y la periferia de la célula representa un excelentes puntos de referencia para ayudaren la orientación de las dos imágenes. </li></ol> 6. Consideraciones críticas <ol><li> Para ayudar mucho en la localización de la molécula pequeña inyectado, una etiqueta fluorescente, tal como rodamina o fluoresceína se pueden unir covalentemente usando kits disponibles comercialmente. Información adicional se gana ectópica expresar una proteína fluorescente marcador localización subcelular antes de la microinyección. Por lo tanto, la elección de fluoróforos y colorante inerte microinyección de seguimiento es importante. </li><li> Elegir las células para la microinyección que se adhieren cerca del centro del cubreobjetos y evitar la elección de una cuadrícula cerca del borde. Esta para presentar una mayor probabilidad de que las células de interés se transfieren a la resina Epon utilizado para microscopía electrónica. </li><li> Confluencia de células is importante, como una placa completamente confluente hará que la identificación de células microinyectados en el microscopio electrónico muy difícil. Más bien, las células de semillas tales que lleguen a ~ 50% de confluencia en el día de un experimento de corta, o ~ 25% de confluencia en el día de un tiempo (1-2 días) experimento. Utilice la posición y forma de las células, así como el espacio &#39;vacío como puntos de referencia para orientar la imagen de microscopía electrónica. </li><li> Espesor óptico confocal rebanada debe ser sintonizado a las necesidades del experimento y por lo tanto debe ser determinada empíricamente 10. </li><li> El formaldehído y el glutaraldehído fijadores deben ser de la más alta calidad disponible. El formaldehído se fijar las células, sin embargo, conservar las propiedades de fluorescencia de ambas proteínas y pequeñas moléculas fluorescentes (tales como rodamina o FITC). Sin embargo, no va a preservar las estructuras para permitir alta resolución EM. Glutaraldehído preserva las membranas y estructuras subcelulares a un alto grado de EM análisissis, pero significativamente obstaculizar fluorescencia. Por lo tanto, la fijación de dos pasos es fundamental tanto para fluorescencia y microscopía de EM. La etapa de fijación de formaldehído se puede omitir si la realización de las mediciones de células vivas, como la fijación definitiva se puede realizar por tratamiento con glutaraldehído. </li></ol> 7. Los resultados representativos Este procedimiento proporciona la capacidad de suministrar una molécula de interés directamente en el citoplasma celular eucariota y vigilar su localización y / o efectos en la arquitectura celular y organeller de milímetro a la resolución de varios nanómetros. Una ilustración esquemática de la configuración experimental y procedimiento se muestra en la Figura 2. Esta técnica se basa en la microinyección de células cultivadas sobre un cubreobjetos de vidrio grabada con láser sobre malla (Fig. 3A), que después de la microscopía confocal, es capaz de transferir tanto de las células de interés, así como el patrón de rejilla a la resina Epon (Fig.3B). Un procedimiento de microinyección CLEM típico produce imágenes de fluorescencia y micrografías de electrones, que combinados entre sí, permiten tanto la localización subcelular y el análisis ultraestructural. Las células cultivadas en un cubreobjetos de vidrio cuadriculada fotoincisa se ​​microinyectan con una molécula de interés después de que las imágenes de campo claro se obtienen (Fig. 4A). Un colorante inerte seguimiento se incorpora para distinguir las células de microinyectados no microinyectados células (Fig. 4B). Confocal z-pilas se obtienen utilizando un fluoróforo u otro identificador unido a la molécula microinyectado pequeña de interés (Fig. 4C). La muestra se fijaron con glutaraldehído y se procesaron para microscopía electrónica. Micrografías electrónicas se obtienen y se superpone a las células a las que corresponden (Fig. 4D). Áreas albergan señales fluorescentes son inspeccionados con mayor detalle a mayor aumento (4E Fig. </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cronograma del procedimiento de microinyección CLEM. Dependiendo de la configuración experimental, microinyección y las mediciones de fluorescencia pueden realizarse en el mismo día. Preparación de la muestra para microscopía electrónica es el más tiempo debido a que consume pasos incubaciones largas y tendrá una duración de 2-3 días. TEM análisis y la correlación de las señales de fluorescencia con imágenes de microscopía electrónica se puede realizar en un solo día. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 Ilustración general del procedimiento de CLEM microinyección Paso 1:.. Localizar las células que crecen en cubreobjetos de vidrio grabado láser reticulados y de microinyectar molécula de interés Paso 2:.. Captura dos imágenes de campo claro y fluorescencia confocal z-pilas de células microinyectados Paso 3: prepararcubreobjetos para EM análisis e incrustar en resina Epon. Usando patrón transferido red, recorte bloquear de manera que las células de interés se encuentran en el vértice Paso 4:. Cortar secciones seriadas con ultramicrótomo Paso 5:. Correlacionar imágenes fluorescentes con EM imágenes. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 patrón de cuadrícula facilita la identificación de las células de interés Panel A representa la microinyección de células cultivadas a ~ 50% de confluencia;. Observar la rejilla de identificador de AK. La barra de escala es de 100 micras. Panel B muestra el patrón de rejilla transfiere desde el cubreobjetos sobre el bloque de resina polimerizada Epon que se seccionará en serie después de la cuadrícula de interés se identifica en un microscopio de disección. Panel C muestra el patrón de rejilla transferido en preparación para seccionar . Tenga en cuenta que el golpeteo de la red transferida es a la inversa en el bloque de resina; scalbar e es de 1200 m. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Figura 4 Los resultados representativos de luz correlativo microinyección y microscopía electrónica El panel A muestra la micrografía de campo brillante de células NRK que crecen en un cubreobjetos de vidrio grabada con láser cuadriculada; flechas indican dos células que se visualizan por CLEM en CD paneles panel B muestra la fluorescencia. del colorante de seguimiento inerte, en este caso Cascade Blue, utilizado para identificar las células que fueron microinyectadas. panel C muestra la superposición de campo brillante y la firma de fluorescencia de rodamina marcado con una molécula pequeña. Las dos celdas mostradas aquí se indican mediante flechas en los paneles A y B. Panel D representa CLEM de campo brillante, microscopía de fluorescencia y electrónica;. Punta de la flecha indica fluorescente puncta fotografiado a mayor aumento en Panel E Las barras de escala son de la siguientemanera: Los paneles A y B, 100 m; C y D, a 50 micras; E, a 100 nm.

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No hay conflictos de intereses se declaran.

El método que aquí se presenta permite la entrega directa de las proteínas, ácidos nucleicos purificados, o pequeñas moléculas al citoplasma eucariótico y proporciona ultra alta resolución a través de análisis de la correlación de microscopía de fluorescencia y electrónica. El uso de este método es simple, pero robusto y se puede realizar en casa con muchas instalaciones de base existentes y / o debidamente equipados laboratorios de microscopía electrónica. La técnica es también sensible a la célula v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cubreobjetos Fotograbado y placa en vivo de células </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascada Azul </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina Etiquetado Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 m unidad de filtración centrífuga </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidrio de borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetas Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-97 </td><td> Utilice el programa n º 4 después de realizar la prueba de rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet sistema de microinyección </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos líquido eliminación </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Microscopio Electrónico de Transmisión </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

La célula eucariota se basa en la compleja, altamente regulado, y los compartimentos de membrana ligados funcionalmente distintas que conservan una polaridad necesaria bioquímico para la correcta función celular. La comprensión de cómo las enzimas, proteínas, y componentes del citoesqueleto gobernar y mantener esta segregación bioquímica tanto, es de suma importancia. El uso de moléculas marcadas con fluorescencia para localizar y / o perturbar los compartimentos subcelulares se ha producido una gran cantidad de conocimientos y avanzar en nuestra comprensión de la regulación celular. Las técnicas de imagen tales como microscopía de fluorescencia confocal y hacer la determinación de la posición de una molécula de marcado fluorescentemente pequeña relativamente sencillo, sin embargo, la resolución de estructuras muy pequeñas se limita 1. Por otra parte, la microscopía electrónica ha revelado los detalles de la morfología subcelular a una resolución muy alta, pero su naturaleza estática hace que sea difícil de medir pro altamente dinámicoprocesos con precisión 2,3. Así, la combinación de la microscopía de luz con el microscopio electrónico de la misma muestra, Light denomina correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) 4,5, proporciona la doble ventaja de formación de imágenes ultrarrápida fluorescente con la alta resolución de la microscopía electrónica 6. Esta poderosa técnica se ha aplicado para estudiar muchos aspectos de la biología celular 5,7. Desde su creación, este procedimiento ha aumentado nuestra capacidad de distinguir las arquitecturas subcelulares y morfologías de alta resolución. A continuación, presentamos un método simplificado para realizar la microinyección rápida seguida de CLEM (Fig. 1). El procedimiento de CLEM microinyección puede ser utilizado para introducir cantidades específicas de moléculas pequeñas y / o proteínas directamente en el citoplasma de células eucariotas y estudiar los efectos de un milímetro a la resolución de varios nanómetros (Fig. 2). La técnica se basa en la microinyecciónlas células cultivadas en cubreobjetos de vidrio grabado láser reticulados fijados a la parte inferior de platos y de formación de imágenes de células vivas con tanto microscopía confocal fluorescente y electrones. La localización de la célula (s) de interés se ve facilitada por el patrón de rejilla, que se transfiere fácilmente, junto con las células de interés, a la resina Epon utilizado para la inmovilización de muestras y corte antes del análisis de microscopía electrónica (Fig. 3). Superposición de fluorescencia y las imágenes EM permite al usuario determinar la localización subcelular, así como los cambios morfológicos y / o ultraestructurales inducidas por la molécula microinyectado de interés (Fig. 4). Esta técnica es susceptible de puntos de tiempo que van desde ≤ 5 s hasta varias horas, dependiendo de la naturaleza de la muestra microinyectado.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

La técnica CLEM se ha adaptado para analizar la morfología ultraestructural de las membranas, orgánulos, y estructuras subcelulares afectados por moléculas microinyectados. Este método combina las poderosas técnicas de micromanipulación / microinyección, microscopía fluorescente confocal y microscopía electrónica para permitir a milímetro resolución nanométrica múltiples. Esta técnica es viable para una amplia variedad de aplicaciones.

Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K vistas.  University of Texas Southwestern Medical Center. La técnica CLEM se ha adaptado para analizar la morfología ultraestructural de las membranas, orgánulos, y estructuras subcelulares afectados por moléculas microinyectados. Este método combina las poderosas técnicas de micromanipulación / microinyección, microscopía fluorescente confocal y microscopía electrónica para permitir a milímetro resolución nanométrica múltiples. Esta técnica es viable para una amplia variedad de aplicaciones.

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Investigación

Biología

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Nuevo protocolo para la conservación simultánea de fluorescencia y ultraestructura

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

Autor destacado: Avances en microscopía electrónica y de luz correlativa con preservación de proteínas fluorescentes

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.