La localización de proteínas en el contexto de la ultraestructura de la célula ha sido una poderosa herramienta de investigación durante décadas. Con este protocolo, ampliamos las proteínas que son escasas en abundancia o difíciles de localizar. Utilizamos la microscopía de fluorescencia para marcar proteínas de una manera sensible y cribable y la combinamos con microscopía electrónica para rellenar la ultraestructura de la célula.
Aquí demostraremos en la sección CLEM sobre las proteínas de la autofagia, pero realmente se puede aplicar a cualquier cuestión biológica en la que la ultraestructura de la célula sea de interés, especialmente en el estudio de eventos raros. Demostrando el procedimiento conmigo estará Tineke Veenendaal, una técnica de investigación sénior de nuestro laboratorio. Para comenzar, reemplace el PBS que contiene 0.15% de glicina con 1% de gelatina en PBS precalentado a 37 grados Celsius.
Raspe y transfiera las células en gelatina a un tubo de microcentrífuga. Granular las células a 6.000 G durante un minuto a temperatura ambiente en una microcentrífuga y luego retirar la gelatina sin alterar el gránulo. Añadir un 12% de gelatina calentada a 37 grados centígrados al pellet y volver a suspender suavemente pipeteando con puntas de pipeta o pipetas de vidrio para pastos precalentadas a la misma temperatura.
Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego pellet las células a 6.000 g durante un minuto. Solidifica la gelatina en hielo durante 30 minutos. Para eliminar las células incrustadas en gelatina del tubo, corte el extremo del tubo que contiene el gránulo del resto del tubo con una cuchilla de afeitar.
A continuación, corte el extremo del tubo con el gránulo de la celda por la mitad perpendicular al primer corte. Coloque las dos mitades de los extremos del tubo que contienen el gránulo celular en sacarosa molar 2.3 e incube durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Esto hace que las mitades de los gránulos celulares se encojan ligeramente y se desprendan del tubo de plástico.
Retire las mitades del tubo con el gránulo celular incrustado en gelatina de la sacarosa y luego retire las mitades del gránulo celular de las mitades del tubo de plástico con pinzas. Corta manualmente el gránulo en bloques de un tamaño adecuado con una cuchilla de afeitar y utiliza un microscopio de disección estereoscópica para ampliar el sujeto durante el corte. Incubar los bloques celulares durante la noche en sacarosa molar 2,3 a cuatro grados centígrados.
Colóquelos en un pasador portamuestras de aluminio. Deje suficiente sacarosa alrededor de los bordes del bloque para que forme un collar delgado entre el bloque y el alfiler. Congélelo y guárdelo en nitrógeno líquido.
Recorta la parte frontal del bloque para aplanar su superficie y obtener secciones de alrededor de 250 nanómetros de grosor. A continuación, recorte los lados del bloque seccionando de 50 a 100 micrómetros en el lado de la cara del bloque de muestra con la esquina de la cuchilla. Recortar cuatro lados de la cara del bloque de muestra creará un rectángulo que sobresale de alrededor de 250 por 375 micrómetros.
Separe una cinta del rectángulo que sobresale, asegurándose de que las secciones tengan entre 70 y 90 nanómetros de grosor y tengan un brillo dorado plateado. Guíe las secciones lejos del filo del cuchillo de diamante con un pelo en un palo para crear una cinta larga. Levante la cinta sumergiendo el bucle de recogida de tres milímetros en una mezcla uno a uno de sacarosa molar 2,3 y metilcelulosa al 2%.
Inserte el bucle en la cámara criogénica del micrótomo y, una vez que la gota comience a congelarse, recoja rápidamente las secciones presionando suavemente la gota contra ellas. Retire el asa de la cámara criogénica. Espere hasta que la gota se haya descongelado por completo y presione la gota sobre una rejilla preparada.
Coloque las rejillas con secciones de alrededor de un mililitro de PBS en un plato pequeño o plato de pocillos múltiples e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Procese las rejillas en alrededor de 75 microlitros de gotas en Parafilm y comience con lavados de glicina PBS a temperatura ambiente. Incubar las rejillas con un tampón de bloqueo compuesto por 0,1 % de albúmina C sérica bovina y 0,5 % de gelatina de piel de pescado en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente como paso de bloqueo.
Diluir los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo en PBS e incubar las rejillas en unas 10 gotas de microlitros de esta solución durante una hora a temperatura ambiente. Lavar las rejillas en albúmina sérica bovina al 0,1% en PBS cinco veces a temperatura ambiente. Diluir los anticuerpos secundarios y DAPI en el tampón de bloqueo en PBS.
A continuación, incube las rejillas en unas 10 gotas de microlitros de esta solución durante 30 minutos o más a temperatura ambiente antes de lavar las rejillas en PBS cinco veces, como se ha mostrado anteriormente. Para montar las muestras para microscopía óptica, sumerja las rejillas en glicerol al 50% en agua destilada dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque una rejilla por cubreobjetos entre un portaobjetos de vidrio y un cubreobjetos al 50% de glicerol, asegurándose de que las secciones estén orientadas hacia el cubreobjetos.
Para microscopía óptica, lleve un portaobjetos de vidrio con las rejillas intercaladas a un microscopio de campo amplio con una platina automatizada. Seleccione un objetivo de óleo de gran aumento y cree un conjunto de mosaicos de imagen de la cinta de secciones. A continuación, para el desmontaje y la microscopía electrónica o el contraste EM, agregue 10 microlitros de agua destilada al costado del sándwich deslizante de la cubierta deslizante de vidrio y espere la acción capilar para llenar la interfaz del sándwich deslizante de la cubierta de vidrio.
Retire con cuidado el cubreobjetos sin mezclar el aceite de inmersión en el glicerol. Recupere las rejillas con pinzas y sumérjalas en agua destilada tres veces a temperatura ambiente para eliminar el 50% de glicerol. Seque cuidadosamente la parte posterior de la rejilla con un papel de seda sin pelusa y coloque la sección de la rejilla con el lado hacia abajo sobre gotas de agua destilada.
Para teñir las secciones para contrastar en microscopía electrónica, incubarlas con acetato de uranilo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Enfríe la solución de metilcelulosa de acetato de uranilo colocando las gotas en Parafilm en una placa de metal sobre hielo. Luego lave las rejillas con esta solución helada dos veces e incube en la solución durante 10 minutos.
Realice un bucle de secado de rejilla insertando un bucle de secado de rejilla en la gota de metilcelulosa de acetato de uranilo debajo de cada rejilla y levantándola suavemente hasta que la rejilla se desprenda de la gota. Para secar el exceso de solución, toque el bucle en un ángulo de aproximadamente 60 grados sobre el papel de filtro sin pelusa y arrástrelo lentamente a lo largo del papel hasta que no se absorba más solución. Coloque el lazo con la rejilla en una rejilla adecuada y déjelo secar a temperatura ambiente durante más de 10 minutos.
Utilice la visión general obtenida por microscopía óptica para localizar una región de interés para la obtención de imágenes en el microscopio electrónico de transmisión o TEM, y anote el ROI en el conjunto de datos de microscopía óptica. Una vez seleccionada una región, obtenga un mosaico de imagen establecido con un aumento de 20.000x a 50.000x en el TEM. Reconstruya el conjunto de mosaicos de imágenes en el software de posprocesamiento.
Realizar la correlación basada en la señal DAPI y la fluorescencia y los contornos nucleares en microscopía electrónica. Cambie las imágenes para superponerlas con precisión y realice la correlación manual con precisión. Las células HEPG2 derivadas del hepatoblastoma se sometieron a privación de alimentos durante dos horas en EBSS antes de la fijación con paraldehído al 4% durante dos horas.
Las imágenes de FI de LC3 y LAMP1 en secciones revelan relativamente pocos puntos de LC3 y poca colocalización con LAMP1. La información molecular de la FI se vinculó a la información ultraestructural obtenida en microscopía electrónica mediante la superposición de las dos modalidades de imagen basadas en DAPI y contornos nucleares. La correlación de los orgánulos positivos para LC3 con la ultraestructura EM reveló que los diferentes puntos representaban distintas etapas de la autofagia.
Aquí se muestra la ultraestructura de los compartimentos individuales etiquetados con LC3, como se ejemplifica en el cuadro uno. Las imágenes de microscopía electrónica de luz correlativa se muestran a la izquierda, y las imágenes de microscopía electrónica pseudocoloreada se muestran a la derecha. Las membranas autofagosomales internas y externas están indicadas por puntas de flecha blancas y negras.
Curiosamente, EM identificó puntos fluorescentes relativamente débiles como autolisosomas LC3 positivos, que se caracterizan por un contenido denso y vesículas intraluminales. Esto revela una visibilidad mínima de LC3 en FI de secciones criogénicas ultradelgadas, lo que sugiere LC3 detectable en autolisosomas de estado estacionario a pesar del entorno degradativo. Sin embargo, los puntos positivos de LC3 representan principalmente autofagosomas y pocos autolisosomas.
Para los investigadores que desean realizar el marcaje de inmunogold en lugar de CLEM en sección, los protocolos y consejos descritos aquí también son totalmente aplicables para el etiquetado de immunogold. Inicialmente aplicamos CLEM en sección a proteínas reguladoras endosomales de baja abundancia y mostramos por primera vez su localización ultraestructural endógena.
