Apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 NS37253 y NS055167 N01) y la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (RG 3288-A6).

1. Preparación CFA-antígeno emulsionado <ol><li> Disolver cobaya MBP (preparado de acuerdo con el método de Swanborg1 y se almacena en forma liofilizada a 4 ° C) en solución tampón de fosfato (PBS) a una concentración de 2 mg / ml. Si sintetizados péptidos MBP (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 se utilizan, preparar una solución de 2 mg / ml. Elaborar una cantidad apropiada de solución de antígeno (0,1 ml por ratón para ser vacunados) en una jeringa de vidrio con luer-lok. </li><li> Elaboración de un volumen de adyuvante completo de Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) igual a la solución de antígeno en otra jeringa de vidrio equipado con Luer-lok. </li><li> Conecte los dos jeringas de vidrio con una llave de tres vías. Mezclar la solución con el Comité de Libertad Sindical MBP empujando los émbolos de ida y vuelta. Mantener el movimiento hasta que se forma una emulsión. </li><li> Para probar si se forma una emulsión, empujar toda la mezcla en una jeringa. Desconecte la jeringa vacía, tire tque el émbolo hacia atrás un poco y descargue una gota de la emulsión residual en un vaso de agua limpia a temperatura ambiente. Si la caída de emulsión permanece intacto en la superficie del agua, se forma una emulsión. Si la caída de la emulsión se dispersa, vuelva a conectar las jeringas y seguir el movimiento de mezcla. </li><li> Utilizar una jeringa de plástico de 1 ml para el proceso de inmunización para asegurar la entrega de una dosis exacta de antígeno. Para transferir la emulsión de antígeno a la jeringa de plástico, saque el émbolo e inserte la jeringa de plástico vacía en la apertura de llave de tres vías donde se desconecta la jeringa de vidrio anterior como en el punto 1.4. </li><li> Llenar la jeringa de plástico a la llanta, empujando el émbolo de la jeringa de vidrio. Insertar el émbolo de la jeringa de plástico hacia atrás y empujar hacia atrás el exceso de emulsión hasta alcanzar la marca de 1,2 ml en la jeringa de plástico. Esta maniobra asegura que ninguna burbuja de aire está atrapado dentro de la jeringa de plástico. </li><li> Retirar la jeringa de plástico de la llave de tres vías. Attach una aguja de calibre # 26 a la jeringa de plástico. Empuje el émbolo hasta la marca de 1 ml de modo que la emulsión ahora llena el volumen vacío de la aguja. </li></ol> 2. La inmunización de ratones donantes Nota: Los ratones hembra C57BL / 6 se suele inyectar una emulsión de antígeno en cuatro sitios en los flancos, siguiendo los métodos diseñados originalmente por el grupo de McFarlin de tres de los Institutos Nacionales de Salud. Para un investigador experimentado, una persona puede realizar toda la tarea. Para los principiantes, la ayuda puede ser solicitada para que una persona tiene el ratón y la otra persona hace de la inyección. Por otra parte, el ratón puede ser anestesiados para la inyección. <ol><li> Sostenga firmemente el ratón por la piel del cuello y contener la cola entre los dedos 4 º y 5 º de tal manera que el tórax y el abdomen son de fácil acceso. </li><li> Colocar la aguja de la jeringa de plástico 1 ml en un sitio en el tórax ligeramente por encima de la axila derecha (de la MOutilizar) e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno por vía subcutánea. Una protuberancia poco del blanquecino CFA puede ser visto a través de la piel pálida. Repetir lo mismo para el sitio en el tórax ligeramente por encima de la axila izquierda. </li><li> Suelte la cola y agarrar el pie derecho (del ratón), enciéndalo y sostenerlo entre el 4 º y 5 º dedos. Busque el sitio justo debajo de la caja torácica en el lado derecho e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno. </li><li> Suelte el pie derecho, gire el ratón hacia otro lado y mantener el pie izquierdo (del ratón) entre los días 4 y 5 º dedos. Localizar el sitio justo debajo de la costilla caso en el flanco izquierdo e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno. </li><li> Cambie a una aguja nueva después de la inyección de 10 ratones, o entorpecido si la aguja se hace. </li></ol> 3. Aislamiento de células de nódulos linfáticos de Cultivo de Tejidos de 7 a 10 días después de la inmunización <ol><li> Siete a 10 días después de la inmunización, el sacrificio de los ratonesy extraer los ganglios linfáticos de drenaje. El método preferido de la eutanasia es por inhalación de CO 2. Después del sacrificio, coloque el cursor sobre su espalda en una tabla de disección con las extremidades estiradas y se fija a la placa con alfileres. Los ratones se humedecen con una pulverización de 70% de etanol. </li><li> Cortar una hendidura en la piel longitudinalmente en el centro desde el extremo inferior del abdomen hasta la barbilla con tijeras y pinzas estériles. </li><li> Cortar la piel del abdomen de la zona de la ingle hasta cada pierna. Despegue y precisar la piel, la exposición de los ganglios linfáticos inguinales. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la patas delanteras (izquierda y derecha) para que la piel se puede pelar la espalda y clavado hacia abajo para mostrar los ganglios linfáticos de la axila cerca de las axilas. </li><li> Con dos pares de pinzas que trabajan juntos, alejarse de los tejidos conectivos que cubren y alrededor de los ganglios linfáticos inguinales. Cuando los tejidos conectivos se borran, coloque un par de pinzas en el ganglio linfático y se alejan del cuerpo. Coloque elganglios linfáticos en un plato de Petri de 35 mm lleno de PBS estéril. </li><li> Extraiga los tejidos conectivos que cubren los dos ganglios linfáticos axilares con dos pares de pinzas. Aislar los ganglios linfáticos y colocarlos en la placa de Petri. Tenga mucho cuidado de no romper los vasos sanguíneos que cruzan la zona como el sangrado facilita la identificación de los ganglios linfáticos muy difícil. </li><li> Después de todos los ganglios linfáticos se recogen, mover la placa de Petri con una campana de seguridad biológica. Romper y se burlan de los ganglios linfáticos aparte con los dos pares de pinzas, moler uno contra el otro. Alternativamente, los ganglios linfáticos puede ser roto mediante el extremo plano del émbolo de una jeringa de plástico de 3 ml presionando contra los ganglios linfáticos en la parte inferior de la placa de Petri. </li><li> Pase el nodo linfático bromeó suspensión celular a través de una malla de nylon para eliminar las membranas y escombros. </li><li> Completar el ganglio linfático suspensión de células a 50 ml con PBS estéril. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos. Resuspender el precipitado en medio de cultivo. ¿Es viable cell contar y ajustar la concentración de 4 x 10 6 células / ml. UseRPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico MEM, 0,1 mM MEM no esenciales aminoácidos, 100 penicilina U / ml, estreptomicina 100 mg / ml, 10 mM de tampón Hepes y x 5 10 -5 M 2-ME. Pre-caliente la cultura antes de resuspender las células. </li><li> Cultivar las células en placas de cultivo de 24 pocillos con un volumen de 2 ml por pocillo (concentración final de células 8 x 10 6 células / pocillo). Añadir antígeno a cada pocillo a una concentración final de 100 g / mL. Coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Se incuban las células durante 5 días. </li></ol> 4. La recolección cultivadas células de nódulos linfáticos 5 días después del inicio de las Culturas <ol><li> Mezclar las células en cada pocillo pipeteando arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur de vidrio o una pipeta pequeño volumen. Recoger las células a un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Centrifugar las células a 1000 rpm durante 10 minutos. Resuspenden el sedimento celular en un pequeño volumen de PBS. </li><li> Contar las células y ajustar la concentración de células viables a 2,5 x 10 8 células / ml con PBS estéril. Dibujar las células en una jeringa provista de una aguja de calibre # 26. </li><li> Coloque una lámpara de calor sobre la jaula de los ratones receptores para ayudar a dilatar la vena de la cola. </li><li> El uso de un soporte de ratón, extender la cola del ratón a través de la hendidura en el soporte. Tire para extender la cola. Localice la vena. </li><li> Inyectar 0,2 ml / ratón de la suspensión celular, igualando 5 x 10 7 células. </li></ol> 5. Antigénica desafío de los ratones receptores de la célula 20 días después de la transferencia y el desarrollo de los síntomas de la enfermedad <ol><li> Los ratones receptores Challenge que no presentan signos de la enfermedad con el antígeno. Los procedimientos son los mismos que en el apartado 2 sobre &quot;La inmunización de ratones donantes&quot;. </li><li> Observar el desarrollo de la enfermedad paralítica 7 a 10 días después del desafío antigénico. <ol><li> Enfermedad comienza con debilidad en la cola. La enfermedad se clasifica como unacuando la cola se vuelve flácido. La enfermedad se clasifica como 2 cuando el ratón está paralizado en una pata trasera. La enfermedad se clasifica 3 cuando ambos miembros posteriores están paralizadas y el ratón arrastra los dos miembros posteriores al rastrear hacia adelante. La enfermedad se clasifica 4 cuando el ratón pierde uso de ambas extremidades anteriores, dejando el ratón totalmente inmóvil. La enfermedad se clasifica 5 cuando el ratón está moribundo y el cuerpo se curva hacia arriba. La muerte se califica como enfermedad de grado 6 4. </li></ol></li><li> MBP-específica EAE inducida en ratones C57BL / 6 después de este protocolo es monofásica. Los ratones pueden recuperarse de la enfermedad, pero no someterse a las recaídas espontáneas. </li></ol> 6. Los resultados representativos Los ratones que recibieron cebado e in vitro-expandidas células de los ganglios linfáticos de los donantes no desarrollaron síntomas de EAE enfermedades, reflejando su resistencia a la inducción de la enfermedad. Sin embargo, la enfermedad grave desarrollado después del desafío antigénico (Tabla I), demostrando la capacidad de la estimulación antigénicaen revertir el mecanismo de resistencia. Dos características especiales de la estimulación antigénica señalar son las dosis de antígeno y la cinética de reto para provocar la enfermedad. Dosis muy baja de antígeno que se necesita, como se muestra en la Tabla III. Sorprendentemente, los ratones que recibieron células de donantes del año anterior puede todavía desarrollar una enfermedad grave cuando fueron estimulados con el antígeno (Tabla IV). Estas dos observaciones sugieren fuertemente la participación de &quot;larga vida&quot; las células T en el mantenimiento de la resistencia a la EAE. Este protocolo es aplicable a muchas cepas de ratones resistentes a la EAE 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del diseño experimental para la inducción de la EAE en prestigiosas cepas de ratones resistentes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Clínica de EAE después de la transferencia adoptiva </td><td colspan="3"><strong&gt; Clínica EAE después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> Tensión </td><td> Antígeno </td><td> incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango) </td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td><td> Incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango) </td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21/21 </td><td> 4.0 (3-5) </td><td> 8.0 (6-10) </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0/10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7/7 </td><td> 3.85 (3-5) </td><td> 9.28 (9-10) </td></tr><tr><td> Ratones Balb / c </td><td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5/5 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 7.0 (7) </td></tr><tr><td> C3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 8.0 (8) </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60-80 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 2.75 (2-4) </td><td> 10.2 (9-11) </td></tr></tbody></table> Tabla I. La inducción de MBP-mediada por la EAE en ratones C57BL / 6. La transferencia adoptiva de la EAE preparada y en las células del donante in vitro, la ampliación no inducir en ratones C57BL / 6. Desafío antigénico después de la transferencia de células prestados los ratones susceptibles a la inducción de la enfermedad. Av.., Promedio. ND, no hacer. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> Cebado antígeno </td><td> La exposición al antígeno </td><td> Incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango)</td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> CFA solos </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> MBP-MIA </td><td> 3/3 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 7.7 (7-9) </td></tr></tbody></table> Tabla II. La especificidad de una estimulación antigénica. Los ratones receptores fueron desafiados con el antígeno de cebado, así como otros antígenos irrelevantes. Sólo el antígeno cebado inducido enfermedad grave. OVA: ovoalbúmina de pollo. Av.., Promedio. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> Dosis de la exposición al antígeno (ug / ratón) </td><td> Incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango) </td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4/4 </td><td> 3.67 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4/4 </td><td> 3.25 (3-4) </td><td> 8.25 (7-10) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (8-9) </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.76 (8-9) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4/4 </td><td> 2.5 (2-3) </td><td> 9.75 (9-10) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2/4 </td><td> 1.0 (1.0) </td><td&gt; 16 (14-18) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla III. Dosis de antígeno Challenge necesaria para la inducción enfermedad. Varias concentraciones de MBP se utilizan para desafiar a los ratones receptores fueron probados. Av.., Promedio. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> La exposición al antígeno </td><td> Día del Desafío </td><td> Incidencia </td><td> Av.. Enfermedades de grado (Rango) </td><td> Av.. Día de inicio (Rango) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 5 </td><td> 3/4 </td><td> 1.33 (1-2) </td><td> 9.67 (9-10) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 10 </td&gt; <td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 15 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 7.25 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 8.0 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 35 </td><td> 4/4 </td><td> 3.5 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 60 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 9.0 (8-10) </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 343 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 10.33 (10-11) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 445 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 7.0 (7.0) </td></tr></tbody></table> Tabla IV. Cinética de la estimulación antigénica. Los ratones receptores fueron impugnadas en el puesto de varios punto de momento, adoptarive la transferencia de células. Av.., Promedio.

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	<li>Swanborg, R. H., Sabato, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis.">Experimental allergic encephalomyelitis.</a> Methods in Enzymology. 162, 413-421 (1988).</li><li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice:+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage.">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li><li>McCarron, R., McFarlin, D. 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Los estudios de la EAE en ratones a menudo utilizan los neuroantigens, la proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) o las proteínas de mielina de oligodendrocitos (MOG). Estudios anteriores utilizan sobre todo MBP. PLP estimula respuestas fuertes y consistentes de los ratones SJL. Más recientemente, MOG es el neuroantigen común usado porque ratones B6 son susceptibles a la inducción de la enfermedad con este antígeno. Muchas de las cepas de ratón de genes específicos están en el fondo B...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Conejillos de Indias la médula espinal </td><td> Rockland inmuno-químicos, Inc. Gilbertsville, PA 19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td> congelado </td></tr><tr><td> Adyuvante de Freund, completo H37Ra </td><td> Difco Laboratories Detroit, MI </td><td> 231131 </td><td></td></tr><tr><td> Multifit intercambio de jeringas, capaz de </td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com / us</a> </td><td> 512133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> MediatechInc. Manassas, VA <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> Sigma-Aldrich <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Ratones </td><td> Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine </td><td> Ratones B6: 0000664 </td><td></td></tr></tbody></table>

overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) y se ha utilizado como un modelo animal para el estudio de la enfermedad desmielinizante humana, la esclerosis múltiple (MS). EAE se caracteriza por la infiltración patológica de células mononucleares en el SNC y por la manifestación clínica de la enfermedad paralítica. Similar a la EM, EAE es también bajo control genético en que ciertas cepas de ratón son susceptibles a la inducción de la enfermedad, mientras que otros son resistentes. Por lo general, C57BL / 6 (H-2 b) los ratones inmunizados con la proteína básica de mielina (MBP) no presenta signos de parálisis. Esta falta de respuesta no es ciertamente debido a defectos en el procesamiento de antígenos o la presentación de antígenos de MBP, como un protocolo experimental descrito aquí se han utilizado para inducir EAE severa en ratones C57BL / 6, así como otras cepas de ratón reputadas resistentes. Además, encefalitógenas clones de células T de los ratones C57BL / 6 y ratones Balb / c reactivas a MBP había sido éxitocompletamente aislado y propagado. El protocolo experimental implica el uso de un sistema celular en el que la transferencia adoptiva MBP-cebado (200 ug / ratón) C57BL / 6 donantes células de ganglios linfáticos se aislaron y cultivaron durante cinco días con el antígeno para ampliar el grupo de células T específicas de MBP. Al final del período de cultivo, 50 millones de células viables se transfieren a ingenuos receptores singénicos a través de la vena de la cola. Los ratones receptores así tratados no suelen desarrollar EAE, reafirmando así su condición resistentes, y pueden permanecer normal por tiempo indefinido. Diez días después de la transferencia de células, los ratones receptores tienen el desafío de adyuvante completo de Freund (CFA)-MBP emulsionada en cuatro sitios en los flancos. EAE severa comienza a desarrollarse en estos ratones de diez a catorce días después del desafío. Los resultados mostraron que la inducción de la enfermedad fue específico antigénica como desafío con antígenos irrelevantes no indujo signos clínicos de enfermedad. Significativamente, una titulación de la dosis de antígeno utilizado paradesafiar los ratones receptores mostró que podría ser tan baja como 5 ug / ratón. Además, un estudio cinético de la temporización de una estimulación antigénica mostró que desafío para inducir la enfermedad fue eficaz tan pronto como 5 desafío antigénico días después y mientras más de 445 días post desafío antigénico. Estos datos apuntan claramente hacia la participación de una &quot;larga vida&quot; población de células T en el mantenimiento de la falta de respuesta. La participación de las células T reguladoras (Tregs) en este sistema no está definido.

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Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

20.2K vistas.  St. John-Providence Health System. Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Video: Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Investigación

Inmunología e Infección

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

Uveítis autoinmune experimental: un modelo de ratón inflamatorio intraocular

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

Mejora de la inmunogenicidad por Mycobacterium paratuberculosis en la encefalomielitis autoinmune

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) containing inactivated Mycobacterium tuberculosis. The antigenic components of the mycobacterium activate dendritic cells to stimulate T-cells to produce cytokines that promote the Th1 response via toll-like receptors. Therefore, the amount and species of mycobacteria present during the antigenic challenge are directly related to the development of EAE. This methods paper presents an alternative protocol to induce EAE in C57BL/6 mice using a modified incomplete Freund&#39;s adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strain K-10.
M. paratuberculosis, a member of the Mycobacterium avium complex, is the causative agent of Johne&#39;s disease in ruminants and has been identified as a risk factor for several human T-cell-mediated disorders, including multiple sclerosis. Overall, mice immunized with Mycobacterium paratuberculosis showed earlier onset and greater disease severity than mice immunized with CFA containing the strain of M. tuberculosis H37Ra at the same doses of 4 mg/mL. The antigenic determinants of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP)&#160;strain K-10 were able to induce a strong Th1 cellular response during the effector phase, characterized by significantly higher numbers of T-lymphocytes (CD4+ CD27+), dendritic cells (CD11c+ I-A/I-E+), and monocytes (CD11b+ CD115+) in the spleen compared to mice immunized with CFA. Furthermore, the proliferative T-cell response to the MOG peptide appeared to be highest in M. paratuberculosis-immunized mice. The use of an encephalitogen (e.g., MOG35-55) emulsified in an adjuvant containing M. paratuberculosis in the formulation may be an alternative and validated method to activate dendritic cells for priming myelin epitope-specific CD4+ T-cells during the induction phase of EAE.

Autor destacado: Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental  

Here, we present an alternative protocol to actively induce experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, using the immunogenic epitope myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspended in incomplete Freund's adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...