Todo el trabajo se realizó en el Centro Duke para la microscopía in vivo, una NIH / NIBIB nacional de Tecnología Biomédica del Centro de Recursos (P41 EB015897) y Instituto Nacional del Cáncer de imágenes de Pequeños Animales del Programa de Recursos (U24 CA092656). El apoyo adicional fue proporcionado por la NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).

1. Montar y calibrar el sistema ultrasonido <ol><li> El sistema de ultrasonidos se inicia con un transductor de ultrasonidos de un solo elemento con un diámetro lo suficientemente amplia como para cubrir el cerebro de ratón y una frecuencia central en el intervalo de 2 Mhz. El transductor es impulsado por un amplificador 50-dB de potencia, que está conectada a un generador de señal que produce la secuencia de pulsos de ultrasonido. </li><li> Para calibrar la presión acústica del sistema de ultrasonidos, utiliza un hidrófono para relacionar el voltaje aplicado a la presión acústica resultante. Coloque el transductor en un tanque de agua sobre el hidrófono. Aplicar un pulso simple (por ejemplo, una sinusoide 10-ciclo a la frecuencia del transductor con una frecuencia de repetición de impulsos de 10 Hz) para el transductor. Utilice una etapa de traducción de 3 ejes para encontrar la respuesta del pico, el cual debe estar en el centro del haz de ultrasonidos en el foco natural del transductor (aproximadamente 60 mm para nuestra transductor 13 mm de diámetro MHz 2,15). </li><li> Tome varias medidas más de un sonare de tensiones de entrada (por ejemplo, 50-400 mV pp) para verificar la linealidad del sistema. Utilizar una regresión lineal simple para estimar la relación entre la tensión de entrada y la presión acústica. En nuestro sistema, los voltajes de entrada de 258 y 167 mV pp correspondía a pico negativas presiones acústicas de 0,52 y 0,36 MPa. </li><li> Programa el generador de señales para producir una secuencia de pulsos de ultrasonido que consta de ráfagas de impulsos sinusoidales en la frecuencia del transductor con 50000 ciclos por explosión y un período de ráfaga de 64 ms. En base a las mediciones de calibración, ajustar la amplitud del pulso para generar pico negativas presiones acústicas de 0,36 MPa en el centro del foco natural del transductor. </li></ol> 2. Preparar los reactivos <ol><li> Disolver cloruro de manganeso tetrahidratado (MnCl 2 .4 H 2 O) en agua estéril a una concentración de 100 mM (300 mOsm) y el filtro de esterilizar. </li><li> Producir el lípido perflutren microesferas &quot;activating &quot;el vial en el agitador suministrado por el fabricante durante 45 s. Para un día de experimentos, un solo vial puede ser activado una vez al comienzo del día y utilizado sin reactivación para el resto del día. </li><li> Inmediatamente antes de la administración de microesferas, agitar el vial con la mano durante 1 minuto para volver a suspender las microesferas. Al retirar microburbujas del vial, no se inyecte aire ambiente en el vial, ya que esto degrada las microburbujas restantes. Deje el vial hasta que el último uso de la jornada, a continuación, guárdelo en el refrigerador. Mantenida de esta manera, un solo vial puede durar varios días. Re-activar el vial almacenado en el agitador, antes de la primera utilización en los días siguientes. </li></ol> 3. Preparación de Animales <ol><li> Se anestesia a los animales con isoflurano, entregado por cono de la nariz. El aparato de cono de la nariz debe estar diseñado para fijar la cabeza del animal precisa y fiable en la misma posición cada vez. Nuestro equipo mantiene 15 º en la cabezae &quot;cráneo-plano&quot; la posición (es decir, la superficie del cráneo dorsal es horizontal) utilizado en el atlas de Paxinos cerebral 16. Valorar la anestesia para mantener una frecuencia respiratoria entre 85 y 125 respiraciones por minuto. Mantenga la temperatura del cuerpo, utilizando una lámpara de calor o de aire soplado. Proteger los ojos con el lubricante. </li><li> Retire el cabello del cuero cabelludo del ratón utilizando una cortadora eléctrica. </li><li> Colocar un catéter vena de la cola y un catéter intraperitoneal (IP). Para los estudios de supervivencia, asegúrese de usar una técnica estéril apropiada; la colocación del catéter IP se muestra en el video de este artículo es apropiada sólo para experimentaciones sin supervivencia. </li><li> Haga los preparativos adicionales necesarios para el experimento de estimulación neuronal. Por mapeo de la estimulación de la corteza vibrisas campo barril, utiliza un microscopio de disección y tijeras de microcirugía para cortar el vibrisas lo más cerca posible a la superficie de la piel sin irritar el folículo o piel circundante. </li><li> Coloque el gel de ultrasonido en elcuero cabelludo y, a continuación inferior una columna de agua contenida por una lámina delgada de plástico (por ejemplo, un 7,6 micras basura bolsa de basura) en el cabezal. Acceda a través de la columna de agua con un hisopo con punta de algodón para expulsar las burbujas de aire que quedan atrapadas en el gel de ultrasonido. Coloque el transductor de ultrasonido a su distancia focal natural (58 mm) directamente sobre el cerebro del ratón en la columna de agua y limpie el transductor con la punta del dedo para eliminar las burbujas de aire atrapadas. </li></ol> 4. Barrera hematoencefálica con microburbujas de apertura y de sonido Ultra (BOMUS) <ol><li> Dale una inyección intraperitoneal de la solución de manganeso a una dosis de 0,5 mmol / kg IP. Se tapa el catéter intraperitoneal de modo que el manganeso no fluye hacia fuera, y esperar 10 minutos para permitir que se distribuya (Figura 1). </li><li> Para abrir la BBB, administrar 30 l de lípidos perflutrén microesferas (DEFINITY activado) a través del catéter vena de la cola, y simultáneamente, iniciar la secuencia de pulsos de ultrasonido. Cigan insonification durante 3 minutos. </li></ol> 5. La estimulación neuronal <ol><li> Deje aproximadamente 40 minutos para los niveles cerebrales de Mn 2 + para estabilizar antes de comenzar la estimulación neuronal. De esta manera, la mejora dramática de referencia debido a Mn 2 + difusión a través de la BBB se puede distinguir de la mejora diferencial sutil debido a la estimulación. A continuación, comenzar la estimulación con su paradigma de elección (Figura 1). </li><li> Para la estimulación de vibrisas, apague el isoflurano y quitar el cono de la nariz. Mover un pincel suave artista manualmente en un movimiento circular (1-5 Hz) a través de la matriz vibrisas a una distancia de aproximadamente 2-5 mm de la piel. Continúe la estimulación durante 90 minutos. El manganeso tiene un efecto sedante que permite la estimulación incontrolada del animal. Si el animal se pone inquieto, administrar 5% de isoflurano a través de cono de la nariz durante 15 segundos aproximadamente. </li></ol> 6. Magnetic Resonancia <ol><li> Después de la estimulación, reanudar la anestesia a través de cono de la nariz. Continuar manteniendo la temperatura corporal y el nivel de titulación de isoflurano a una frecuencia respiratoria de 85 a 125 respiraciones por minuto. </li><li> Coloque el ratón en una bobina de la RM y la transferencia al sistema de resonancia magnética. Adquirir 3D de alta resolución en T1 imágenes de RM. Por ejemplo, use un gradiente 3D malcriado recordó eco (SPGR) de secuencia con los siguientes parámetros: tiempo de repetición de 25 ms, el tiempo de eco de 2 ms, ángulo de inclinación de 30 grados, ancho de banda de 15,63 kHz; campo de visión de 20 × 20 × 12 mm; matriz de 128 x 128 x 60. </li></ol> 7. Análisis de Imagen <ol><li> Análisis de la imagen es específica para el paradigma estimulación utilizado. Para el experimento de estimulación vibrisas (Figura 2), importar las imágenes de varios animales en un entorno de análisis adecuado. Si algunos animales se estimularon a la derecha, mientras que otros se estimularon a la izquierda, FLip alguna manera que todas las imágenes son efectivamente &quot;a la izquierda-estimulado.&quot; Entonces, para comparar el lado estimulado de cada cerebro a su lado contralateral no estimulada, crear un duplicado y reflejado a la izquierda-no estimulada conjunto de imágenes se crea. Registro de todas las imágenes a un espacio común y luego suavizar con un 3 × 3 × 3 píxeles kernel gaussiano. </li><li> Exportar los datos a un entorno de análisis matemático, como MATLAB. Opcionalmente, enmascarar la anatomía pertinente en las bases de datos. De intensidad normalizar las imágenes por el método iterativo de Venot et al. 17,18. </li><li> Use un dos a dos, de una sola cola de pruebas t para comparar cada voxel de los lados de cada cerebro estimulado a la contralateral voxel correspondiente a los lados no estimulados de cada cerebro. </li><li> Muestra el valor de p resultante mapa para identificar las regiones de actividad diferencial (Figura 3). </li></ol> 8. Los resultados representativos El método que aquí se presenta tiene dos fondos<html> amental medidas: (1) apertura BBB con microburbujas y ultrasonido (BOMUS) y (2) la activación inducida por el manganeso potenciado por resonancia magnética (MRI AIM). Debido a que el último paso depende del primero, es importante verificar BOMUS exitosos de implementación. La interrupción de la barrera sangre-cerebro después de la administración de una T 1-acortamiento agente de contraste (tales como manganeso o un agente de gadolinio) se traduce en un aumento de la señal en el parénquima cerebral en T 1-imagen ponderada en comparación con los cerebros en la que BOMUS no se realizó (Figura 4). La distribución de esta mejora de manganeso no es completamente uniforme, aunque es bastante constante entre los animales. La distribución refleja no sólo falta de homogeneidad en la abertura de BBB, pero también es la intrínseca distribución no uniforme de Mn en el cerebro 19. La dinámica espacial y temporal de la apertura de BBB se han descrito anteriormente más 12. ent &quot;&gt; Una vez BOMUS ha sido implementado con éxito, el siguiente paso es llevar a cabo AIM RM Muchos paradigmas experimentales son posibles.. Sin embargo, debido a que hay muchos factores de confusión potenciales, los controles y los análisis deben diseñarse cuidadosamente los efectos de confusión incluyen homogénea apertura BBB, la acumulación heterogénea de Mn en el cerebro, la dinámica temporal de la difusión de Mn y la actividad neuronal específica. En esta demostración, la respuesta neuronal a la estimulación unilateral de las vibrisas fue asignada. Para tener en cuenta las heterogeneidades y Mn de flujo, sin estimulación del lado de cada cerebro Se utilizó como control interno. Para dar cuenta de la actividad inespecífica neuronal que puede variar entre los animales, el análisis utilizado pruebas estadísticas para identificar las regiones que fueron sistemáticamente diferente entre los animales (Figura 2). Los resultados fueron un mapa diferencia tridimensional y un tridimensional valor p mapa (Figura 3), el lado derecho de la cual se indica regionesde la más alta de la señal contralateral a la vibrisas estimulado. El lado izquierdo del mapa indica que las regiones tenían señal significativamente mayor ipsilateral al vibrisas estimulada. El mapa de p-valor identificado una amplia región de la señal de elevada contralateral a la vibrisas estimulado que corresponde al campo de barril de la corteza sensorial primaria, cuya respuesta a la estimulación vibrisas ha sido ampliamente documentada por los estudios de electrofisiología 20,21 y 2-desoxiglucosa. Una discusión más completa de estos resultados ha sido publicado previamente 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig1.jpg" /> Figura 1. Protocolo para la línea de tiempo con la neuroimagen funcional BOMUS y AIM resonancia magnética (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de esquema para la identificación de regiones of diferente intensidad entre los lados estimuladas y no estimuladas de cada cerebro. Para comparar el lado estimulado el cerebro de cada uno a su lado contralateral no estimulada, un duplicado y reflejado a la izquierda-no estimulada conjunto de imágenes se crea. Estas imágenes están registradas, se filtró, y normalizado. Por último, en la prueba se comparan las imágenes izquierda y se fue estimulada estimuladas. El test de la t es &quot;emparejado&quot;, de modo que el lado estimulada de cada cerebro está sólo en comparación con el lado no estimulada del mismo cerebro. La prueba t es &quot;una sola cola&quot; de modo que un lado del mapa de p-valor indica la señal significativamente mayor en el lado estimulado del cerebro, mientras que el otro lado del mapa de p-valor indica la señal significativamente mayor en el lado de la unstimulated cerebro (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados de análisis conjunto de 7 animales en dos posiciones axiales diferentes. T<html> que la primera columna muestra la media de todas las imágenes registradas alineados, por lo que efectivamente todos los ratones tenían su vibrisas izquierda estimulado. Estas imágenes se superpone con un mapa de color que indica el porcentaje de incremento en promedio de la señal en cada voxel relativa al hemisferio contralateral, como se indica por la barra de color. Regiones coloreadas en la parte derecha de la imagen muestran que el hemisferio contralateral a la estimulación tenía mayor relación señal. Regiones coloreadas en la parte izquierda de la imagen muestran que el hemisferio ipsilateral a la estimulación tenía mayor relación señal. La segunda columna muestra las mismas imágenes superpuestas con el mapa de p-valor que indica la significación estadística del aumento de la señal. La tercera columna muestra el mismo valor de p mapa superpuesto a las cifras correspondientes del atlas estereotáxica Paxinos 16 con los campos de cañón de la corteza sensorial sombra (Adaptado de Howles et al. 13). / 4055/4055fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Distribución espacial de Mn 2 + en el cerebro. Las imágenes fueron adquiridas 170 minutos después de 0,5 IP MnCl mmol / kg de 2-BOMUS tratados (n = 5) y control (n = 4) ratones. Después de la normalización, la media y desviación estándar de los mapas se calcularon (panel izquierdo). Mejora fue mayor en los ratones tratados con BOMUS. A pesar de esta mejora no fue uniforme a través del cerebro, que era bastante coherente, excepto cerca de los bordes del cerebro y los ventrículos. Uso de las regiones de interés (ROI) dibujados alrededor de diversas estructuras, la media de SNR (+ 1 SD) se calculó a través de cada grupo (panel derecho). BOMUS los animales tratados mostraron una mayor SNR, sino también una mayor variación entre las estructuras y entre los animales (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig5.jpg" /> Figura 5. Para examinar los efectos de tejido de BOMUS, los cerebros de los ratones tratados con BOMUS se fijaron, en síctioned a 500 - intervalos de micras, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. El número medio de células sanguíneas rojas extravasaciones vistos en cada sección del cerebro se muestra para presiones acústicas de 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), y 5,0 MPa (n = 1). Las barras de error muestran el error estándar. El segundo panel muestra un ejemplo de grave extravasación de células rojas de la sangre del cerebro expuesto a 5,0 MPa (Adaptado de Howles et al. 12). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig6.jpg" /> Figura 6. Las pruebas de comportamiento cuantitativo se utilizó para evaluar la actividad, la excitación y la capacidad de respuesta antes de la anestesia, y 3 y 24 horas después de la recuperación de la anestesia. El sistema de puntuación, descrito previamente 12, se basó en la evaluación bien establecido de comportamiento del ratón cuantitativa desarrolloed por Irwin en 1968 22. El comportamiento de la media (± SEM) La puntuación para el control (n = 3) y BOMUS (0,36 MPa), tratamiento (n = 8) los animales se muestra. En relación con la línea de base pre-anestesia, todos los animales muestran una disminución en la puntuación de la conducta 3 horas después de la anestesia, pero en gran medida por la recuperación al día siguiente. En cada momento, no se observaron diferencias entre los dos grupos, lo que indica que BOMUS no afectará sensiblemente el comportamiento animal (Adaptado de Howles et al. 12).

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S., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese:+Recent+advances+in+understanding+its+transport+and+neurotoxicity.">Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).</li><li>Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+auditory+pathway.">Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway.</a> Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).</li><li>Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI.">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+mapping+of+sound-evoked+activity+in+the+mouse+auditory+midbrain+using+Mn-enhanced+MRI.">Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 39, 223-230 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Aquí, un método no invasivo fue presentado por la apertura de la BBB a través del cerebro del ratón entero con ultrasonido y microburbujas (BOMUS). Con la apertura de BBB, Mn 2 + fue administrada y la activación inducida por el manganeso potenciado por resonancia magnética (MRI AIM) se utilizó para la respuesta neuronal a la imagen de corta duración en ratones estimulación ligeramente sedado. Adecuado apertura BBB se logró con una presión acústica de pico negativo de 0...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Hidrófono </td><td> Sonora Medical Systems, Longmont, CA </td><td> SN-251 S4 </td><td></td></tr><tr><td> Traducción fase </td><td> Newport Corporation, Irvine, CA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El ultrasonido transductor </td><td> Olympus NDT, Inc., de Waltham MA </td><td> A306S-SU </td><td> Examen hoja del fabricante de prueba que acompaña al transductor para encontrar el centro exacto de la frecuencia que transductor en particular, que puede diferir de la frecuencia nominal que figuran en el catálogo. (Por ejemplo, la frecuencia nominal de nuestro transductor fue de 2,25 MHz, pero la frecuencia central real fue 2,15 MHz). </td></tr><tr><td> Vevo imágenes de la estación </td><td> VisualSonics, Inc. de Toronto, Canadá </td><td>; </td><td></td></tr><tr><td> 50 dB amplificador de potencia </td><td> E &amp; I, Rochester, NY </td><td> modelo 240L </td><td></td></tr><tr><td> Generador de señales </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> modelo 33220A </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 - (H2O) 4 </td><td> Sigma </td><td></td><td> El peso molecular varía según el lote, llame al fabricante para la medición exacta </td></tr><tr><td> Perflutren microesferas de lípidos </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Boston, MA </td><td> DEFINITY </td><td></td></tr><tr><td> Microesferas agitador </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Boston, MA </td><td> Vialmix </td><td></td></tr><tr><td> RM bobina de </td><td> M2M Imaging Corp., Hillcrest, OH </td><td></td><td> 35 mm de diámetro en cuadratura de transmisión / recepción bobina volumen </td></tr><tr><td> Sistema de resonancia magnética </td><td> GE Healthcare, Milwaukee, WI </td><td></td><td> GE consola EXCITE operar un imán 7-T horizontal agujero </td></tr><tr><td> Entorno de análisis de imagen </td><td> Visage Imaging, San Diego, CA, The MathWorks, Natick MA </td><td> Amira MATLAB </td><td></td></tr></tbody></table>

functional neuroimaging using ultrasonic blood-brain barrier disruption and manganese-enhanced mri

Aunque los ratones son el sistema de modelo dominante para el estudio de las bases genéticas y moleculares de la neurociencia, la neuroimagen funcional en ratones sigue siendo un reto técnico. Uno de los enfoques, la activación inducida por el manganeso potenciado por resonancia magnética (MRI AIM), ha sido utilizado con éxito para mapear la actividad neuronal en roedores 1-5. En AIM resonancia magnética, Mn 2 + actúa como un análogo de calcio y se acumula en las neuronas despolarizadas 6,7. Debido a Mn 2 + se acorta la T 1 propiedad del tejido, las regiones de la actividad neuronal elevada mejorará en la RM. Además, Mn 2 + borra lentamente desde las regiones activadas, por lo tanto, la estimulación puede realizarse fuera del imán antes de la imagen, permitiendo una mayor flexibilidad experimental. Sin embargo, debido a Mn 2 + no atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica (BBB), la necesidad de abrir el BBB ha limitado el uso de resonancia magnética de AIM, sobre todo en los ratones. Una herramienta para la apertura de la BBB es ULTrasound. Aunque potencialmente perjudicial, si el ultrasonido se administra en combinación con microburbujas llenas de gas (es decir, los agentes de contraste por ultrasonidos), la presión acústica requerida para la apertura BBB es considerablemente menor. Esta combinación de ultrasonidos y microburbujas puede ser utilizada para abrir de forma fiable la BBB sin causar daño a los tejidos 8-11. Aquí, se presenta un método para la realización de AIM resonancia magnética mediante el uso de microburbujas y ultrasonido para abrir la barrera hematoencefálica. Después de una inyección intravenosa de microburbujas perflutren, un haz desenfocado ultrasonido pulsado se aplica a la cabeza del ratón afeitado durante 3 minutos. Para simplificar, nos referimos a esta técnica de Apertura BBB con microburbujas y ultrasonido como BOMUS 12. Usando BOMUS para abrir la BBB lo largo de ambos hemisferios cerebrales, manganeso se administra al cerebro de ratón conjunto. Después de la estimulación experimental de los ratones ligeramente sedado, AIM resonancia magnética se utiliza para asignar la respuesta neuronal. ADemostramos este enfoque, en este documento y la RM BOMUS AIM se utilizan para asignar estimulación unilateral mecánica de las vibrisas en ratones ligeramente sedado 13. Debido BOMUS puede abrir la BBB lo largo de ambos hemisferios, el lado no estimulada del cerebro se utiliza para controlar para la estimulación de fondo no específica. El mapa resultante de la activación 3D está de acuerdo también con las representaciones de las regiones publicados vibrisas del campo de la corteza barril de 14. La apertura de ultrasonidos de la BBB es rápido, no invasivo y reversible, y por lo tanto este enfoque es adecuado para los estudios de alto rendimiento y / o longitudinales en ratones despiertos.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Una técnica se describe en términos generales para la apertura de la barrera sangre-cerebro en el ratón utilizando microburbujas y ultrasonido. Usando esta técnica, el manganeso se puede administrar al cerebro del ratón. Debido a que el manganeso es un agente de contraste de MRI que se acumula en las neuronas despolarizadas, este enfoque permite imágenes de la actividad neuronal.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

functional-neuroimaging-using-ultrasonic-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K vistas.  Stanford University. Una técnica se describe en términos generales para la apertura de la barrera sangre-cerebro en el ratón utilizando microburbujas y ultrasonido. Usando esta técnica, el manganeso se puede administrar al cerebro del ratón. Debido a que el manganeso es un agente de contraste de MRI que se acumula en las neuronas despolarizadas, este enfoque permite imágenes de la actividad neuronal.

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Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

La medición del valor subjetivo de las opciones arriesgado y ambiguo utilizando Economía Experimental y Métodos funcionales de resonancia magnética

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Investigación

Neurociencias

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

RM funcional Optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in remote locations. This paper shows the development of field functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) imaging to the study of child language, reading, and cognitive development in a rural village setting of C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and the development of culturally appropriate neuroimaging protocols allow&#160;a first-time look into the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in understudied environments. This paper demonstrates protocols for transporting and setting up a mobile laboratory, discusses considerations for field versus laboratory neuroimaging, and presents a guide for developing neuroimaging consent procedures and building meaningful long-term collaborations with local government and science partners. Portable neuroimaging methods can be used to study complex child development contexts, including the impact of significant poverty and adversity on brain development. The protocol presented here has been developed for use in C&#244;te d&#39;Ivoire, the world&#39;s primary source of cocoa, and where reports of child labor in the cocoa sector are common. Yet, little is known about the impact of child labor on brain development and learning. Field neuroimaging methods have the potential to yield new insights into such urgent issues, and the development of children globally.

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy NIRS Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches (functional Near Infrared Spectroscopy) provide advances to the study of the brain in previously inaccessible regions; here, rural C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and development of culturally-appropriate neuroimaging protocols permits novel study of the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in environments with significant poverty and adversity.

Campo de neuroimaging métodos funcionales cerca espectroscopia infrarroja (NIRS) neuroimagen para estudiar el desarrollo Global del niño: zonas rurales de África subsahariana

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Un enfoque de sobremesa para la ubicación específica de la barrera hematoencefálica que se abre con ultrasonido enfocado en un modelo de rata

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Role of Diffusion MRI Tractography in Endoscopic Endonasal Skull Base Surgery

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of benign and malignant lesions through a natural anatomical extra-cranial pathway, represented by the nasal cavities, avoiding brain retraction and neurovascular manipulation. This is reflected by the patients' prompt clinical recovery and the low risk of permanent neurological sequelae, representing the main caveat of conventional skull base surgery. This surgery must be tailored to each specific case, considering its features and relationship with surrounding neural structures, mostly based on preoperative neuroimaging. Advanced MRI techniques, such as tractography, have been rarely adopted in skull base surgery due to technical issues: lengthy and complicated processes to generate reliable reconstructions for inclusion in the neuronavigation system. 
This paper aims to present the protocol implemented in the institution and highlights the synergistic collaboration and teamwork between neurosurgeons and the neuroimaging team (neurologists, neuroradiologists, neuropsychologists, physicists, and bioengineers) with the final goal of selecting the optimal treatment for each patient, improving the surgical results and pursuing the advancement of personalized medicine in this field.

We present a protocol to integrate diffusion MRI tractography in patient work-up to endoscopic endonasal surgery for a skull base tumor. The methods for adopting these neuroimaging studies in the pre- and intra-operative phases are described.

Papel de la tractografía por resonancia magnética de difusión en la cirugía endoscópica endonasal de la base del cráneo

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of ...

Medición de la resistencia transendotelial para evaluar la integridad de la barrera celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor destacado: Aplicaciones de la detección de TEER para evaluar la integridad de la barrera celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...