AK es apoyado por la Fundación Oppenheim y RH con el apoyo de la Fundación Velux. Agradecemos I. Krumbein de técnica y K. Buder apoyo histológico, y J. Goldschmidt (Instituto Leibniz de Neurobiología, Magdeburg, Alemania) para el asesoramiento técnico en la tinción de TIMM.

Todas las intervenciones de los animales se realizaron de acuerdo con el Convenio Europeo para la Atención Animal y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Todos los experimentos son aprobados por el comité de ética local. El procedimiento de la lesión en ON en los ratones se describe en otro 9. 1. Intravítreas de manganeso Inyección <ol><li> Realice el Mn 2 + de la inyección de 24 horas antes de la MR scan con la ayuda de un asistente. Se anestesia a los animales mediante inyección intraperitoneal de una solución de hidrato de cloral 5% (420-450 mg / kg de peso corporal en PBS estéril). Para la anestesia tópica adicional, aplique una gota de conjuncain líquido (0,4% de clorhidrato de oxibuprocaína) a la córnea antes de la punción de los ojos. Para inyectar 15 nmol Mn 2 + por ojo preparar una mM de MnCl solución de 7,5 2, por ejemplo, mediante la dilución de 1 L de solución 2 M de MnCl de stock 1 en 132 LH 2 &lt;/ Sub&gt; O. Carga 5 l de la solución final en una jeringa de 5 l Hamilton conectado a una aguja extraíble pequeño cubo 34 G (la aguja RN). </li><li> Al comenzar con el ojo derecho, coloque el ratón del lado izquierdo con un microscopio binocular y suavemente abierta y fijar el ojo derecho entre el pulgar y el dedo índice de su mano izquierda. Tome la jeringa con la mano derecha y sujete la aguja cerca de la punta. Para la punción atraumática del bulbo ocular, insertar cuidadosamente la aguja en el cuerpo vítreo en la circunferencia inferotemporal aproximadamente 1 mm distal al limbo, evitando de ese modo los vasos esclerales. </li><li> A continuación, el asistente se aplica lentamente el volumen total de 2 l, mientras que el control de la escala de la jeringa Hamilton. Durante este procedimiento, el seguimiento óptimo de colocación de la aguja en el microscopio y evitar la punción de la lente o el derrame del líquido. Mantenga la aguja insertada de forma estática para un 30 sec adicional, a continuación, retirar lentamente para minimizar el líquidopérdidas en el lugar de la inyección. </li><li> Durante todo el procedimiento, la atención especial se debe tomar para evitar la presión en el ojo. Del mismo modo, evitar tentativas fuertes o numerosas para perforar la bombilla de ojo. Desde Mn 2 + absorción en la CGR y el transporte a lo largo del EN ya está saturado a 15 nmol MnCl2, esto minimiza las variaciones de la señal por los volúmenes de inyección ligeramente imprecisos. Para mejorar la señal bilateral de la proyección visual, repita el procedimiento de inyección para el ojo izquierdo. </li><li> Aplicar ofloxacina que contienen (3 mg / ml) colirios y ungüentos que contengan pantenol-una vez después del procedimiento para prevenir las infecciones oculares y secado del ojo. Volver a los ratones a sus jaulas en condiciones normales de alojamiento hasta el inicio de la exploración de RM. </li></ol> 2. Preparación de los animales para la RM <ol><li> Se anestesia el ratón por administración de una mezcla de gas isoflurano / oxígeno 2% / 98%. Monte el ratón sobre un soporte de ratón en una posición casi horizontal, sin torsión. InsERT en la bobina de RM, que se ajusta entonces en el interior del escáner de RM. Monitorear la respiración y la frecuencia cardíaca mediante sistemas adecuados. Para más detalles técnicos, véase Herrmann et al 20. </li><li> Durante la RM, la anestesia de suministro por insuflación continua de un inicialmente 1.5% / 98.5% mezcla de gas isoflurano / oxígeno a través de un evaporador conectado a la titular de la cabeza del ratón por un tubo integrado. Durante la exploración, ajustar la profundidad de la anestesia según los parámetros vitales registrados (es decir, aspirar a una tasa de respiración estable de alrededor de 40 respiraciones por minuto). El uso de un dispositivo de calentamiento a mantener la temperatura de la superficie corporal estable entre 35 y 37 ° C, medida por un sensor térmico colocado en el sitio abdominal del ratón. Para más detalles técnicos, véase Herrmann et al 17. </li><li> Después de la exploración, liberar el ratón del soporte y suministrándole oxígeno puro para acelerar la recuperación de la anestesia. Además, mantener la temperatura corporal estable mediante el uso deuna fuente de calor la luz roja. </li></ol> 3. Protocolo de resonancia magnética <ol><li> El protocolo es validado por un Tesla escáner 3 equipado con una, bobina dedicada SNR-eficiente de pequeños animales (polarizada linealmente bobina Litz) con un campo de visión efectivo de 35 mm × 38 mm de diámetro. Haga funcionar la bobina en modo de transmisión-recepción. </li><li> Con el animal en su posición definitiva, ajuste la melodía y el partido de la bobina con la ayuda de un analizador de frecuencias. Ajuste manualmente el voltaje de referencia del transmisor y las corrientes de la calza para optimizar la homogeneidad y calidad de imagen. </li><li> Adquirir en T1 imágenes de EET en 2D con una resolución de 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm en vista sagital y transversal para la planificación. El uso de la planificación de resonancia magnética, adquirir las imágenes MEMR en la dirección de medición coronal, girado para ser paralelo a la cabeza del animal con la codificación de fase a lo largo de la dirección izquierda-derecha. Para reducir al mínimo el tiempo de adquisición, utilizar un campo rectangular de vista ajustada a laDimensiones del cabezal de reales. Emplear una secuencia FLASH 3D mimada (VIBE 3D) con los siguientes parámetros: la matriz de base 256, el campo de visión de 54 mm × 50,65 mm x 14,08 mm, con un 93,8% campo rectangular de vista en la dirección de codificación de fase, y 128 láminas de 0,11 mm grosor de corte con la resolución rebanada establece en un 61%. </li><li> Activar la interpolación en el plano para crear imágenes finales con 512 × 480 × 128, proporcionando una resolución efectiva de 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm × 0,1 mm × 0,09 mm interpolan), tiempo de eco T E = 6,51 mseg, tiempo de repetición TR = 16 ms, ancho de banda = 160 Hz / px, flip = ángulo 22 °. Aplicar dos medias y tres repeticiones para lograr un tiempo de adquisición total de (T a) de aproximadamente 30 min. </li></ol> 4. Análisis de los datos de resonancia magnética <ol><li> Analizar los datos utilizando el fastView syngo software. Para mejorar la señal cuantitativa, seleccione las regiones definidas of interés en grabaciones de resonancia magnética planares 2D y determinar las intensidades de señal (SI) de la estructura reforzada (SI MEMRI), fondo del tejido (SI backgr), y la desviación estándar del ruido (DS N). Cuando sea necesario, utilice un atlas del cerebro del ratón para facilitar la orientación neuro-anatómico para LGN y estructuras SC. Calcular la relación de contraste a ruido (CNR) usando la fórmula: </li><li> CNR = (SI MEMRI - SI backgr) / SD N </li><li> Cuantificar tres imágenes consecutivas para cálculo de la media CNR para cada muestra. En los animales inyectados bilateralmente, analizar cada hemisferio de forma independiente. </li><li> Para la representación de imágenes horizontales, coronal y sagital, reconstrucciones multiplanares cálculo del conjunto de datos 3D MRI inicial. Estas imágenes procesadas no son recomendables para el análisis cuantitativo. Para crear reconstrucciones 3D animados (proyecciones de máxima intensidad, MIP) de la retinopatía-Tectal proyección, utilice un módulo de software de post-procesamiento de la angiografía. </li></ol> 5. Mn 2 + autometalografía (TIMM tinción) <ol><li> Para la tinción de TIMM de Mn 2 + estructuras cerebrales trazadas siguiendo MEMRI, inyecte una dosis de 15 a 150 nmol Mn 2 + ivit 24 horas antes de la proyección de imagen. </li><li> Después de escanear el MR, perfundir los animales con 30 ml enfriado con hielo 0,325% de Na 2 S en PBS (pH 7,4). Diseccionar retinas y congelar las muestras en la sección congelada. </li><li> Cortar secciones secuenciales, ecuatoriales de 15 micras de espesor sobre una cryotome. </li><li> Realizar tinción TIMM 21 en ausencia de fijador y crioprotección de acuerdo con Angenstein et al 22. </li></ol> 6. Análisis estadístico Realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t de Student para las comparaciones individuales, seguido de correo ANOVA hoc. Los datos se presentan como media ± error estándar. Números individuales de N sondado por separado para cada experimento. Resultados alcanzando P ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativas (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

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	<li>Kretz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+promotes+heat+shock+protein+27+expression+and+Akt+activation+in+the+rat+retina+and+protects+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo.</a> Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+therapy+stimulates+long-distance+regeneration,+target+reinnervation,+and+partial+recovery+of+vision+after+optic+nerve+injury+in+mice.">Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+axon+regeneration+in+the+adult+mouse+optic+nerve+and+partial+recovery+of+simple+visual+behaviors.">Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).</li><li>Goetze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vision+and+visual+cortical+maps+in+mice+with+a+photoreceptor+synaptopathy:+reduced+but+robust+visual+capabilities+in+the+absence+of+synaptic+ribbons.">Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons.</a> Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Pautler, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+repeated+topical-loaded+manganese-enhanced+MRI+on+the+mouse+visual+system.">Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

MEMRI del sistema visual se extiende técnicas neurobiológicos convencionales para evaluar la funcionalidad en condiciones no tratados previamente y patológicos. Además de proporcionar una visión única de la integridad de un hecho aislado CNS tracto de fibras, MEMRI puede ser fácilmente complementado con pruebas de comportamiento, por ejemplo, optometría y tareas a base de agua visualmente, para investigar las consecuencias inmediatas de un determinado paradigma de la percepción visual. También vincula...

Sobre la base de su estructura neuro-anatómico favorable el sistema visual del roedor ofrece posibilidades únicas para evaluar compuestos farmacológicos y su capacidad para mediar en la neuroprotección 1 o efectos pro-regenerativas 2,3. Por otra parte, permite que los estudios sobre las características funcionales y neuro-anatómico de ratones mutantes, en fecha tan reciente ejemplifica para los ratones que carecen de la proteína de andamiaje presináptico Fagot 4. Además, un amplio espectro de herramientas complementarias ofrece que ofrece adicional de células de la retina ganglio (RGC) y los números de los axones de CGR así como la actividad de RGC, por ejemplo, por el electrorretinograma y pruebas de comportamiento, y la determinación de los reordenamientos corticales por imagen óptica de señales intrínsecas. Las últimas novedades técnicas en microscopía láser permiten una visualización in situ de regeneración RGC por imágenes de fluorescencia de tejido profundo en el conjunto de montaje de especímenes del nervio óptico (NO) y el cerebro. En este histopatología,enfoque ical, tetrahidrofurano basado claro tejido en combinación con hoja de luz de microscopía de fluorescencia permite la resolución de las fibras individuales que se vuelva a introducir en el SOBRE deafferented y el tracto 5 óptica. Si bien tales técnicas pueden ser superiores en la resolución y la determinación de los patrones de crecimiento, que no permiten análisis repetitivos y longitudinales de los eventos individuales de crecimiento, que son particularmente deseables para evaluar el proceso de regeneración a largo plazo. Mejorada de contraste de RM ha sido empleado para la visualización mínima invasiva de la proyección retino-tectal en ratones y ratas 6,7. Esto puede lograrse mediante la entrega intraocular directa de iones paramagnéticos (por ejemplo, Mn 2 +) a células de la retina. Como un análogo de calcio, Mn 2 + se incorpora en RGC somata a través de canales de calcio dependientes de voltaje y transportados activamente a lo largo del citoesqueleto axonal del EN intacto y tracto óptico. Mientras se acumula en núcleos cerebralesde la proyección visual, es decir, el núcleo geniculado lateral (LGN) y colículo superior (SC), la propagación transsynaptic en la corteza visual primaria parece insignificante 8,9, aunque puede ocurrir 10,11. Bajo secuenciación MR, paramagnético Mn 2 + aumenta el contraste MR principalmente por el acortamiento T1 spin-red tiempo de relajación 12. Tal Mn 2 + mejorado MRI (MEMRI) ha sido aplicado con éxito en varios estudios de neuro-anatómicas y funcionales de las ratas, incluida la evaluación de la regeneración axonal y degeneración después de la lesión SOBRE 13,14, el mapeo anatómico preciso de la proyección de 15 retino tectal , así como la determinación de las características de transporte axonal después del tratamiento farmacológico 16. Mejoras recientes en la dosis, la toxicidad, y la cinética de los protocolos de RM neuronales Mn 2 + captación y el transporte, así como la mejora han extendido su aplicación a los estudios sobre transgénicos9 ratones utilizando escáneres de 3 Tesla de uso común en la práctica clínica 17. Aquí, se presenta un protocolo adecuado para MEMRI longitudinal de imágenes in vivo del ratón proyección retino tectal y ejemplificar su aplicación mediante la evaluación de mejora de la señal de Mn 2 + dependientes en condiciones de neurodegeneración ingenuos y varios. Nuestro protocolo pone especial énfasis en la adquisición de datos de RM en un campo magnético moderado 3 T, que generalmente es más accesible que los escáneres de los animales dedicados. En los ratones no tratados previamente, se expone cómo la intensidad de señal del tracto específico puede ser sustancialmente y reproducible convertirse aumentado después intravítrea (ivit) Mn 2 + aplicación. Cuantitativamente, Mn 2 + de propagación a lo largo de la proyección visual se produce independientemente del proceso de envejecimiento normal (medida entre los ratones 3 y 26 meses de edad) y el aumento es refractario a la estimulación visual y la adaptación a la oscuridad. En contraste, Mn <shasta&gt; 2 + enriquecimiento en los centros talámicos y cerebro medio se reduce siguientes efectos agudos EN lesión por aplastamiento 18, así como en NFKB1 ratones knock-out (KO p50) que sufren de la muerte de las CGR apoptosis espontánea y la degeneración de 19. Por lo tanto, en la expansión a análisis histológico convencional, el análisis de MEMRI longitudinal de animales individuales permite perfiles de la cinética únicas de procesos neurodegenerativos. Esto puede ser muy útil para los estudios sobre la neuroprotección y la regeneración axonal asociada con las intervenciones farmacológicas o genéticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Manganese (II) chloride solution 1M</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M1787</td>
			<td style="width:184px;">MEMRI contrast reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conjuncain</td>
			<td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 7617666</td>
			<td>0.4% oxybuprocaine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Floxal eye drops</td>
			<td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 3820927</td>
			<td>3 mg/ml ofloxacin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ointment panthenol</td>
			<td>Jenapharm, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 3524531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloral hydrate&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">C8383</td>
			<td>420-450 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis, Munich, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 7253744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Hamilton Company, Reno, NV, USA</td>
			<td style="width:119px;">7634-01</td>
			<td>SYR 5 &#181;l, 75 RN, no NDL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">34 G&#160; needle (34/35/pst4/tapN)</td>
			<td style="width:269px;">Hamilton Company, Reno, NV, USA</td>
			<td style="width:119px;">207434/00</td>
			<td>removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Stemi-2000</td>
			<td style="width:269px;">Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3T MRI scanner Magnetom TIM Trio</td>
			<td colspan="2">Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat head coil</td>
			<td>Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse holder</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red light lamp</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Frozen section medium NEG-50</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:119px;">6502</td>
			<td>tissue embedding for cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">106346</td>
			<td rowspan="2" style="width:184px;">for sulfide perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sodium sulfide nonahydrate (Na2S &#215; 9 H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">208043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gum arabic</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">4159</td>
			<td rowspan="5">for TIMM staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hydroquinone (C6H6O2)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">3586</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Citric acid (C6H8O7)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">6490</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O)</td>
			<td style="width:269px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">106448</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Silver nitrate (AgNO3)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">7908</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of optic nerve fiber integrity by contrast-enhanced mri in mice

El sistema visual roedor abarca las células ganglionares de la retina y sus axones que forman el nervio óptico para entrar en los centros talámicos y del cerebro medio, y proyecciones postsinápticos a la corteza visual. Sobre la base de su estructura anatómica distinta y la accesibilidad conveniente, se ha convertido en la estructura favorecida para los estudios sobre la supervivencia neuronal, la regeneración axonal, y la plasticidad sináptica. Los recientes avances en la RM han permitido la visualización in vivo de la parte retino tectal de esta proyección utilizando manganeso mediada aumento del contraste (MEMRI). A continuación, presentamos un protocolo MEMRI para ilustración de la proyección visual en ratones, mediante el cual las resoluciones de (200 m) 3 se puede lograr utilizando escáneres comunes 3 Tesla. Demostramos cómo la inyección intravítrea de una sola dosis de 15 nmol MnCl2 conduce a una mejora de la proyección saturada intacta dentro de 24 horas. Con excepción de la retina, se indepen cambios en la intensidad de la señaldente de la estimulación visual coincidió o envejecimiento fisiológico. Aplicamos aún más esta técnica para supervisar longitudinalmente degeneración axonal en respuesta a la lesión aguda del nervio óptico, un paradigma por el que Mn 2 + transporte completamente detenciones en el sitio de la lesión. Por el contrario, el transporte activo de Mn + 2 es cuantitativamente proporcional a la viabilidad, el número y la actividad eléctrica de las fibras de axones. Para un análisis de este tipo, ejemplificamos Mn 2 + cinética de transporte a lo largo del camino visual en un modelo de ratón transgénico (p50 NF-kB KO) mostrando atrofia espontánea de los sentidos, incluyendo visuales, proyecciones. En estos ratones, MEMRI indica reducida pero no retardada Mn 2 + de transporte en comparación con ratones de tipo salvaje, lo que revela signos de alteraciones estructurales y / o funcionales por mutaciones NF-kB. En resumen, MEMRI puentes convenientemente en ensayos in vivo y post mortem para la histología characterizatisobre la integridad y la actividad de las fibras nerviosas. Es muy útil para los estudios longitudinales sobre la degeneración axonal y la regeneración, y las investigaciones de los ratones mutantes para fenotipos genuinos o inducibles.

La capacidad de esta técnica de imagen para evaluar con precisión la vitalidad y funcionalidad de la proyección visual se basa en la aplicación precisa de un no tóxico Mn 2 + dosificación al cuerpo vítreo y su absorción por las CGR. Esta suposición principal se prueba en la Figura 1, donde la capa específica de Mn 2 + captación se demuestra por autometalografía (tinción TIMM) 21. Retina secciones se analizaron a las 24 horas después de la aplicación de cua...

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In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

Este video muestra un método, utilizando una clínica 3 T escáner, por contraste mejorado la RM del ratón proyección visual ingenuo y para estudios repetitivos y longitudinales en vivo de la degeneración del nervio óptico asociadas con lesión por aplastamiento del nervio óptico aguda y degeneración del nervio óptico crónica en ratones knock-out (KO p50).

Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

13.2K vistas.  Jena University Hospital.  Este video muestra un método, utilizando una clínica 3 T escáner, por contraste mejorado la RM del ratón proyección visual ingenuo y para estudios repetitivos y longitudinales en vivo de la degeneración del nervio óptico asociadas con lesión por aplastamiento del nervio óptico aguda y degeneración del nervio óptico crónica en ratones knock-out (KO p50). 

Video: In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolución<em&gt; En Vivo</em&gt; Protocolo Segmentación Manual for Human hipocampo subcampos Usando 3T Imágenes por Resonancia Magnética

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Grabación de potencial evocado visual en un modelo de rata de Experimental del Nervio Óptico Desmielinización

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

De alta resolución de imagen de resonancia magnética estructural del subcorteza Humano<I&gt; En Vivo</I&gt; Y Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.