Este trabajo fue apoyado por HL094536 (BJH).

1. Aislamiento de mitocondrias de corazón de ratón <ol><li> Para aislar las mitocondrias del corazón, anestesiar y sacrificar ratones de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Cuidado de Animales institucional local, y el empleo. </li></ol> Nota: Todos los pasos del protocolo de aislamiento de las mitocondrias se debe realizar en hielo. Usar búferes frías y pre-enfriados placas Petri, tubos y tubos Falcon Eppendorf. Los volúmenes dados en el protocolo son para una muestra que contiene 2 corazones de ratón. <ol start="2"><li> Eliminar corazones, colocarlos en tampón frío Aislamiento mitocondrias (300 mM de sacarosa, 10 mM Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7,4) y enjuagar la sangre. </li></ol> Nota: Para obtener resultados óptimos, el pH de los tampones mitocondriales se debe ajustar con KOH y ácido acético. <ol start="3"><li> Corazones, colóquelas en una fría placa de Petri, eliminar la grasa y aurículas, y picar finamente con una cuchilla hasta obtenerING un producto homogéneo. </li><li> Transferir los corazones desmenuzados a un tubo Falcon de 50 ml, añadir 10 ml de tampón de aislamiento mitocondrias con 0,1 mg / ml de tripsina y permitir que la muestra de digerir en hielo durante 10 min. </li></ol> Nota: La tripsina durante el procedimiento de aislamiento incrementa el rendimiento de las mitocondrias aisladas y debe mantenerse constante entre las preparaciones mitocondriales. Se recomienda probar las funciones mitocondriales en preparaciones aisladas es la ausencia de tripsina para asegurar que la enzima no interfiere con la funcionalidad. <ol start="5"><li> Añadir 10 ml de tampón de aislamiento mitocondrias con graso 0,1% BSA libre de ácidos y 5 mg de inhibidor de tripsina (soja) y mezclar por veces invirtiendo el tubo varias para neutralizar la tripsina. </li></ol> Nota: tampón de aislamiento mitocondrias pueden ser preparados por adelantado y se pueden almacenar a -20 ° C. Comprobar el pH después de la descongelación. Tripsina, inhibidor de tripsina o BSA debe ser undded al tampón de aislamiento mitocondrias en el día del experimento. <ol start="6"><li> Recuperar el tejido digerido por centrifugación a baja velocidad a media durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el tejido en 8 ml de tampón de aislamiento de mitocondrias con 0,1% de ácido graso libre BSA y se homogeneiza utilizando un homogeneizador Dounce motorizado con una mano de mortero de teflón (4-6 pases en 1,200-14,00 rpm). Mantenga la muestra en hielo mientras se homogeneiza. </li><li> Transferir homogeneizado en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifuga a 800xg durante 10 min a 4 ° C para núcleos de pellets y los restos de tejido. </li><li> Recuperar el sobrenadante que contiene la mitocondria en tubos Eppendorf y se centrifuga a 8.000 xg durante 15 min, a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado la capa superior blanca y lavar el pellet restante más oscuro que contiene la mitocondria en 1 ml de tampón de aislamiento mitocondrias. </li><li> Centrifugar a 8000 xg durante 15 min a 4 ° C. Deseche las mitocondrias pellet sobrenadante y resuspender en 150 l Isola mitocondrialción Buffer. Mantener la mitocondria en hielo durante ensayos adicionales. </li></ol> Nota: Para obtener los mejores resultados durante los ensayos funcionales, utilice las mitocondrias dentro de las 4 horas de aislamiento. <ol start="12"><li> Cuantificar proteína mitocondrial utilizando el ensayo de Bradford. </li></ol> 2. Control de calidad de las mitocondrias aisladas 2,1. Medición de la relación del control respiratorio (RCR) <ol><li> Calibrar el electrodo de oxígeno Oxytherm con agua saturada de aire para establecer la línea de oxígeno máximo. Cuando un nivel estable de oxígeno se obtiene añadir 100 l de una solución recién preparada 10 mM hidrosulfito de sodio para establecer la línea de oxígeno cero. Realizar mediciones a 30 ° C. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de respiración mitocondrias (125 mM KCl, 20 mM de HEPES, 3 mM MgCl 2, 400 mM EGTA, 300 mM TDT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) con rotenona mu M 1 a la cámara de Oxytherm, sellar la cámara y el inicio Recording. </li><li> Cuando la señal de oxígeno es estable, añadir 250 g mitocondrias y la respiración basal registro durante 1 min. La respiración en este punto debe ser muy baja como las mitocondrias se respiran en sustratos endógenos (estado 1 respiración). </li><li> Añadir 5 mM de succinato y señal de grabación durante 1 min. El consumo de oxígeno debe aumentar durante el Estado 2 respiración. </li><li> Inducir el estado 3 respiración mediante la adición de ADP 150 m. En este punto el consumo de oxígeno debe aumentar debido a la síntesis de ATP mediante la fosforilación oxidativa. Record señal hasta que la respiración se ralentiza, lo que indica el consumo de ADP y la transición al estado 4 respiración. Estado Record 4 respiración durante al menos 1 min. </li><li> Añadir 1 mM CCCP y señal de grabación durante 1 min. Desacoplado respiración debe ser máxima. </li></ol> Nota: El efecto de CCCP sobre la respiración mitocondrial es dependiente de la dosis: altas concentraciones de CCCP puede inhibir el consumo de oxígeno y por lo tanto debe ser cuidadosamente titrated. <ol start="7"><li> Calcular la relación del control respiratorio (RCR), dividiendo tasa de consumo de oxígeno durante el estado 3 respiración por la tasa de consumo de oxígeno durante la respiración Estado 4. A RCR objetivo debe ser ≥ 4. </li></ol> 2,2. Evaluación de la integridad de la membrana mitocondrial (citocromo c de prueba) <ol><li> Lave bien la cámara Oxytherm con 70% de etanol y agua y repita los pasos 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Añadir 1 mM ADP y consumo récord de oxígeno durante 1 min. </li><li> Añadir 10 mM citocromo c. Puesto que el citocromo c es impermeable al intactas las membranas mitocondriales, un aumento de la respiración indica roto o dañado membranas mitocondriales. </li></ol> 3. La medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial <ol><li> Configure el espectrofluorómetro para la medición de múltiples parámetros de apertura mtPTP. Utilizando el programa FelixGx, crear una nueva configuración de hardware (Quanta sta maestro establete) que comprende la fuente de luz, monocromador de excitación, compartimento de la muestra y dos detectores posicionados a 90 ° y 270 ° con respecto al monocromador de excitación (Figura 4). Para conseguir una resolución máxima de tiempo, los dos monocromadores de emisión (90 ° y 270 °) debe estar desactivado y los filtros de emisión a 90 ° y 270 ° en el compartimiento de la muestra activada en el menú de configuración de hardware. Este paso se eliminará el control motor de las longitudes de onda de emisión y fijar cada monocromador en una longitud de onda particular. Si los monocromadores de emisión no está incapacitado, cada detector de ciclo entre las dos longitudes de onda y mediciones duplicadas se registró. </li><li> Crear un nuevo protocolo de adquisición utilizando el tipo de tinte multi e introduzca los siguientes colorantes: <ul><li> Fura (alta Ca + +): excitación 340 nm, emisión 525 nm (detector 1) </li><li> Fura (bajo Ca + +): excitación 380 nm, emisión 525 nm (detector 1) </li><li> JC1 (agregado): excitación 543 nm, De emisión 595 nm (detector 2) </li><li> JC1 (monómero): excitación 498 nm, emisión 525 nm (detector 1) </li><li> Hinchazón: excitación 525 nm, emisión 525 nm (detector 1) </li></ul></li><li> Establecer las rendijas de excitación y emisión a 1 nm y la temperatura a 37 ° C. </li><li> Para obtener la señal radiométrica para Fura y JC 1-, generan dos trazos derivados: Fura (alto Ca + +) / Fura (bajo Ca + +) y JC1 (total) / JC1 (monómero). </li><li> Ajustar manualmente la longitud de onda de emisión de los detectores 1 y 2 a 525 nm y 595 nm, respectivamente. </li><li> Mezclar 1 ml de tampón de ensayo Las mitocondrias (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) con rotenona 1 mM, 5 mM de succinato y 800 nM Fura FF en un desechable de 4-lados metacrilato de cubeta. Añadir 250 g de muestra mitocondrias y colocar en el compartimento de la muestra. Asegúrese de que el agitador magnético está encendido. </li><li> Inicie la grabación. Después de 1 min, una pausa en la adquisición, añadir 500 nM JC-1 y reinicie el acquisition. La señal de JC-1 proporción debe aumentar, lo que indica la absorción de colorante por activa mitocondrias. Continuar el registro hasta JC-1 señal ha alcanzado una meseta (usualmente dentro de 5 min). </li><li> Añadir 20 mM CaCl 2. Un aumento instantáneo de la señal en relación Fura FF debe ser observado por el aumento de Ca 2 + en presencia del tampón de ensayo, seguido de una disminución gradual debido a mitocondrial de Ca 2 + captación. La señal de JC-1 relación debe exhibir una disminución transitoria breve indicativo de la despolarización leve membrana mitocondrial. </li><li> Esperar hasta que la señal vuelve Fura FF relación al nivel basal antes de la adición de otro pulso de CaCl 2 (1-1.5 min). Continúe pulsando a intervalos fijos hasta que las mitocondrias no pueden acumular Ca 2 + y comenzará las pruebas de Ca 2 + en el tampón de ensayo. apertura mtPTP es visualizado por un aumento simultáneo de la señal de relación Fura FF debido a la liberación de Ca 2 +, una disminución de la relación señal JC-1 debido a pote membranacolapso ntial, y una disminución de la dispersión de la luz debido a la hinchazón mitocondrial (Figura 5). </li><li> Después de la activación mtPTP, verificar la especificidad de Fura FF, JC 1-y señales de inflamación, respectivamente con 1 mM EGTA, CCCP 1 mM y 5 mg / ml alameticina. </li><li> Para verificar la especificidad de apertura mtPTP, repetir los pasos desde 3,6 hasta 3,9 en presencia de 1 mM de inhibidor de la ciclofilina D ciclosporina A (ciclofilina D es un componente de la mtPTP). En la presencia de ciclosporina A, la apertura de la mtPTP requiere significativamente más CaCl 2 pulsos que las muestras de control (Figura 6). </li></ol> 4. Los resultados representativos La Figura 2 muestra un típico control respiratorio de corazón de ratón mitocondrias aisladas. Estado respiración 3 se consigue mediante la adición de ADP a mitocondrias que respiran en succinato, y se caracteriza por el consumo de oxígeno aumentó significativamente con respecto a la SubstraTE solo. El agotamiento de añadido ADP Estado iniciados 4 respiración, durante la cual el consumo de oxígeno disminuye y es comparable a los índices obtenidos antes de la adición de ADP. RCR se obtiene dividiendo la tasa de consumo de oxígeno para la respiración por Estado 3 Estado 4 que de respiración. El ensayo de citocromo c se usa para ensayar la integridad de la membrana mitocondrial externa: cuando citocromo c se añade a mitocondrias que respiran en succinato y ADP, ningún aumento adicional en la respiración se observa, lo que indica un intacta membranas externas mitocondrial (Figura 3). Una imagen representativa de la apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón se muestra en la Figura 4. En este caso la apertura mtPTP fue desencadenada por la adición de 4 CaCl 2 pulsos (20 mM cada uno) a intervalos de 1,5 min. apertura mtPTP es evidente por la liberación casi simultánea de mitocondrial de Ca 2 + (aumento de la señal Fura relación FF), el colapso de mitochondpotencial de membrana rial (disminución de JC-1 señal de relación) y aumento del volumen mitocondrial (disminución en la señal de hinchazón). Cuando se añade ciclosporina A, que se une al componente de la ciclofilina D de mtPTP, apertura mtPTP requiere 7 pulsos de CaCl 2 en lugar de 4 (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del multi-parámetro protocolo transición de permeabilidad mitocondrial apertura de los poros de las mitocondrias aisladas corazón. Corazón se cosecha a partir de ratones y las mitocondrias se aislaron mediante centrifugación diferencial. La preparación mitocondrial es entonces cualitativamente evaluadas por medición polarográfica de la relación del control respiratorio y intactness membrana mitocondrial en presencia de citocromo c. Transición mitocondrial apertura del poro de permeabilidad en las mitocondrias aisladas se desencadena por secuencial CaCl 2 adiciones y se mide con un espectrofluorómetro mediante el control de liberación de Ca 2 + de la mitocondria colapso membrana, el potencial y la inflamación de la matriz mitocondrial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Figura 2. Medición de relación del control respiratorio (RCR) del corazón mitocondrias aisladas. El consumo de oxígeno por mitocondrias aisladas de corazón se mide durante 3 Estado de respiración en la presencia de succinato y ADP, y durante el Estado 4 respiración después del consumo de ADP. La respuesta de las mitocondrias aisladas a desacopladores se mide por la adición de CCCP. Los números en el gráfico son las tasas de consumo de oxígeno por las mitocondrias aisladas en nmol / min / mg de proteína. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Figura 3. Medida<html> ción de la integridad de membrana de mitocondrias aisladas de corazón. Integridad de la membrana mitocondrial se determinó midiendo el consumo de oxígeno en mitocondrias aisladas en presencia de succinato y ADP y después de la adición del citocromo c. Los números en el gráfico son las tasas de consumo de oxígeno por las mitocondrias aisladas en nmol / min / mg de proteína. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Figura 4. Espectrofluorómetro configuración de hardware para la medición de múltiples parámetros de apertura mtPTP. La configuración de hardware de la espectrofluorómetro incluye una fuente de luz, un monocromador de excitación, un compartimento de muestra y dos detectores con longitudes de onda de emisión fija de 525 nm y 595 nm. Detector 1 se utiliza para la detección de la señal de Fura FF de alto y bajo Ca 2 +, monómero de JC-1, y la señal de hinchazón. Detector 2 mide la señal JC-1 agregado. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Figura 5. Multi-parámetro de medición de apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón. apertura mtPTP fue provocada por adiciones secuenciales de 20 mM CaCl 2 y se caracteriza por Ca 2 + liberación de colapso mitocondrias, potencial de membrana mitocondrial y el aumento de volumen de la matriz mitocondrial (hinchazón). Extramitocondrial Ca 2 + y el potencial de membrana se midió con los indicadores ratiometric Fura FF (verde traza) y JC-1 (curva roja). Hinchazón de las mitocondrias se midió registrando dispersión de luz a 525 nm (negro traza). Especificidad de JC-1 y las señales de inflamación fue probado con CCCP 1 mM y 5 mg / ml alameticina (una toxina microbiana). <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Figura 6. Múltiples-Parámetro de medición de apertura mtPTP corazón en mitocondrias aisladas en presencia de ciclosporina A. ciclosporina A (1 M) aumenta el número de CaCl 2 pulsos necesarios para abrir mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón.

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A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. 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T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo presentado aquí describe los pasos necesarios experimentales para evaluar la permeabilidad de la apertura del poro de transición en el corazón mitocondrias aisladas (Figura 1 y Figura 4): el procedimiento para el aislamiento de corazón de ratón mitocondrias, los controles de las vías respiratorias que garanticen su integridad y funcionalidad, los parámetros monitoreados durante mitocondriales mtPTP apertura y los colorantes empleados para su medición, la creación d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina (soja) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> De hidrosulfito de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Citocromo c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alameticina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> La ciclosporina A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tejido amoladora Potter-Elvehjem con mano de mortero de teflón 15 ml </td><td> Wheaton Industrias </td><td></td></tr><tr><td> Agitador superior </td><td> Wheaton Industrias </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (electrodo de temperatura controlada de oxígeno) </td><td> Instrumentos Hansatech </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 espectrofluorómetro emisión dual </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mtPTP) es un canal no específico que se forma en la membrana mitocondrial interna para el transporte de solutos con una masa molecular inferior a 1,5 kDa. Aunque la identidad definitiva molecular del poro está todavía en debate, proteínas como la ciclofilina D, VDAC y ANT contribuir a mtPTP formación. Si bien la participación de la apertura mtPTP en la muerte celular está bien establecida 1, la evidencia acumulada indica que la mtPTP cumple un papel fisiológico durante mitocondrial homeostasis del Ca 2 + 2, la bioenergética y señalización redox 3. apertura mtPTP se desencadena por matriz Ca 2 +, pero su actividad puede ser modulada por varios otros factores tales como el estrés oxidativo, el agotamiento de nucleótidos de adenina, altas concentraciones de Pi, despolarización de la membrana mitocondrial o desacoplamiento, y ácidos grasos de cadena larga 4. In vitro, mtPTP apertura puede ser ACHieved mediante el aumento de la concentración de Ca2 + en el interior de la matriz mitocondrial a través de adiciones exógenas de Ca 2 + (capacidad de retención de calcio). Cuando los niveles de Ca 2 + dentro de las mitocondrias alcanzar un cierto umbral, la mtPTP abre y facilita la liberación de Ca 2 +, la disipación de la fuerza motriz de protones, la membrana potencial de colapso y un aumento de volumen de la matriz mitocondrial (hinchazón) que en última instancia conduce a la ruptura de la membrana mitocondrial externa y la pérdida irreversible de la función del orgánulo. Aquí se describe un ensayo fluorométrico que permite una caracterización exhaustiva de apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón de ratón. El ensayo involucra la medición simultánea de 3 parámetros mitocondriales que son alterados cuando se produce la apertura mtPTP: mitocondrial de Ca 2 manejo + (absorción y liberación, medida por Ca 2 + de concentración en el medio de ensayo), el potencial de membrana mitocondrial, y mitochovolumen ndrial. Los colorantes empleados para la medición de Ca 2 + en el medio de ensayo del potencial de membrana mitocondrial son Fura FF, una membrana impermeabilizante, indicador radiométrica que sufre un cambio en la longitud de onda de excitación en presencia de Ca 2 +, y JC-1, un catiónico, indicador radiométrica que forma monómeros verdes o rojos agregados en el potencial de membrana de alta y baja, respectivamente. Cambios en el volumen mitocondrial se midió registrando dispersión de la luz por la suspensión mitocondrial. Dado de alta calidad, las mitocondrias funcionales son necesarias para el ensayo de apertura mtPTP, también se describe los pasos necesarios para obtener corazón intacto, altamente acoplado y funcional mitocondrias aisladas.

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo, el volumen potencial de membrana mitocondrial y mitocondrial. El procedimiento para la obtención de corazón de alta calidad y las mitocondrias funcionales también se describe.

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

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Biology

21.4K vistas.  University of Washington, Seattle. Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias Ca 2 + Manejo, el volumen potencial de membrana mitocondrial y mitocondrial. El procedimiento para la obtención de corazón de alta calidad y las mitocondrias funcionales también se describe.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Investigación

Biología

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o<em&gt; En Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.