Los autores desean agradecer a los Dres. Heping Cheng, Huiliang Zhang y Stephen Kolwicz por sus valiosos comentarios y apoyo técnico en el desarrollo de este método. Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH y el Bono de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón para WW.

1. Preparación experimental <ol><li> Preparar la solución isotónica salina equilibrada (50 ml) que contenía: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 2,5 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl 2 y 10 mM de HEPES (pH 7,2) para obtener imágenes de músculo esquelético in vivo. </li><li> Preparar 1 L de tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contiene: NaCl 118 mM, 5,3 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 0,5 mM de EDTA y 25 mM de NaHCO3. </li><li> Burbuja la KHB con gas que contiene 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 10-15 min antes de la adición de 2 mM de CaCl2. Añadir sustratos metabólicos (por ejemplo, 10 mM de glucosa y piruvato 0,5 mM). </li><li> Preparar los instrumentos quirúrgicos mediante la esterilización de la abrazadera, tijeras, fórceps y en etanol al 70% y luego enjuagar en esterilizada ddH 2 O. </li><li> Encienda el sistema de perfusión cardíaca, ajuste la temperatura del baño de agua y bomba de circulación, ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 6 ml / min. </li><li> Burbuja del KHB con 95% de O2/ 5% de CO 2 de gas, y controlar la velocidad de flujo y la temperatura (37 ° C, por una sonda de temperatura de fibra óptica) del efluente. El sistema necesita unos 20 minutos para el gas y la temperatura de equilibrio. </li></ol> 2. Imagen confocal de los músculos esqueléticos en Vivo <ol><li> Anestesie ratón con pentobarbital (80 mg / kg, ip). El animal llegará a la anestesia quirúrgica (sin respuesta a la pizca dedo del pie) dentro de 10 a 15 min y permanecer en este estado durante 1 a 1,5 horas, suficiente para la formación de imágenes in vivo de los músculos esqueléticos. </li><li> Eliminar los pelos en una de las extremidades posteriores y esterilizar la piel con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en la piel a lo largo del lado exterior de la extremidad para exponer los músculos gastrocnemio. </li><li> Levante el epimisio suavemente con un fuerte fórceps y hacer una incisión a través de él con unas tijeras. Además diseccionar para eliminar el epimisio y exponer las fibras musculares debajo de ella. </li><li> Para la carga in vivo de TMRM en el esqueletomuscular, incluyen TMRM (500 nM) en la solución salina balanceada isotónica para sumergir el músculo durante 30 minutos y luego lavar a cabo por la solución de indicador libre. </li><li> Ponga el ratón en su lado en el microscopio confocal (Zeiss LSM 510) escenario y sujetar la extremidad trasera en una posición que el músculo esquelético expuesto se enfrenta contra el cubreobjetos que forma el fondo de la cámara. El cubreobjetos está en entre el tejido muscular y el objetivo invertida (aceite de 40X). </li><li> Pulse la pierna hacia abajo suavemente para hacer contacto estrecho entre el tejido y el cubreobjetos. Sumerja los músculos expuestos en solución salina balanceada isotónica. </li><li> Graba dos (2D, xy) confocal de imágenes tridimensionales en una frecuencia de muestreo de un segundo por fotograma. La intensidad de cada píxel se digitaliza a una profundidad de 8 bits. Por lo general, una exploración de serie contiene 100 marcos. </li><li> Recoge imágenes secuenciales por primera excitante a 405 nm y recogiendo a&gt; 505 nm entonces a 488 nm mientras que la recogida de&gt; 505 nm de longitud de onda dual excitation de imagen de mt-cpYFP. Utilice la excitación secuencial a 405, 488 y 543 nm, y recoger emisión a 505-545, 505-545, y&gt; 560 nm, respectivamente, para el triple longitud de onda de excitación de formación de imágenes de MT-cpYFP y TMRM. </li></ol> 3. Imagen confocal de corazón perfundido Ratón <ol><li> Inmediatamente después de la formación de imágenes in vivo de los músculos esqueléticos, inyectar el ratón con 200 unidades de heparina (IP). Diez minutos más tarde, la eutanasia el ratón por toracotomía y rápidamente quitar el corazón con los pulmones y el timo se le atribuye. </li><li> Quite rápidamente el pulmón en tampón enfriado con hielo. Identificar los lóbulos del timo y pelar suavemente hacia atrás para exponer la aorta ascendente. </li><li> Retire el timo y aislar la aorta quitando cuidadosamente cualquier tejido circundante. </li><li> Haga un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de la primera rama del arco aórtico. </li><li> Sostenga la pared de la aorta suavemente con dos pinzas de micro de sutura para exponer la luz y coloque cuidadosamente la aorta en la cannula (PE50 tubo). La aorta se mantiene en su lugar con una abrazadera micro buque mientras las suturas se atan rápidamente alrededor de la aorta. </li><li> Retire la abrazadera, comprobar cuidadosamente la cánula con una pinza para asegurarse de que la punta de la cánula se encuentra por encima de la raíz aórtica. Lazos adicionales se añaden según sea necesario para mantener el corazón en el lugar. </li><li> Encienda la bomba peristáltica y perfundir el corazón a 1 ml / min. El corazón se reanudará superando a la perfusión. </li><li> Ajuste la posición del sistema de perfusión y poner el corazón en la platina del microscopio. La etapa tiene un adaptador que permite el calentamiento de la cámara que contiene el corazón. </li><li> Añadir 1 ml de solución de perfusión KHB en la cámara para sumergir parcialmente el corazón. Controle la temperatura de la cámara a 37 ° C. Eliminar efluente de la cámara de mediante el uso de una bomba peristáltica. </li><li> Aumentar la velocidad de la bomba peristáltica gradualmente para proporcionar un caudal suficiente (aproximadamente 2 ml / min) para el corazón. </li><li> Después de 10 min de estabilización, perfundir el heaRT con 10 blebbistatin M y 100-500 nM TMRM. Los latidos del corazón se ralentizará después de 10 min. </li><li> Aplicar una suave presión sobre el corazón para asegurar el contacto hermético de la corazón con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara y para suprimir aún más los latidos del corazón. </li><li> Siga el mismo procedimiento con la imagen confocal de miocardio intacto tal como se describe en el paso 2.8 anterior. Ajuste con cuidado el plano focal para mostrar la imagen más clara posible. </li></ol> 4. Procesamiento de imágenes y análisis de datos <ol><li> Utilice las herramientas proporcionadas por el módulo &quot;Análisis fisiológico&quot; del software confocal para analizar los flashes y los cambios potenciales de membrana mitocondrial individuales. Este módulo se incluye a menudo en el software de adquisición de imágenes del sistema confocal y permite la determinación de ciertas áreas de la imagen, así como la salida de intensidad de fluorescencia con etiquetas de tiempo. </li><li> Abra la base de datos y, a continuación el archivo de imagen 2D en serie para ser analizados. </li><li> Haga clic en la &quot;Regiónde interés (ROI) significa &quot;para cambiar a la&quot; media de rendimiento de la inversión &quot;de modo. Haga clic en la&quot; zona de interés (ROI) significa &quot;cambiar a&quot; modo de media de rendimiento de la inversión &quot;. </li><li> Apagar la pantalla de otros canales excepto el canal de cpYFP 488 nm para la selección de los flashes. </li><li> Zoom en la imagen y mover manualmente barra deslizante para reproducir las imágenes en 2D de serie. </li><li> Identificar flashes superóxido mitocondriales individuales localizando el lugar donde la señal aumenta transitoriamente fluorescentes. Utilice la herramienta de ROI adecuado para marcar los flashes. La traza que muestra el cambio de fluorescencia en función del tiempo de cada ROI se mostrará junto a la imagen. </li><li> Después de seleccionar todos los flashes, encienda la pantalla de otros canales. Seleccione un retorno de la inversión en la imagen exterior de la célula para el fondo de la señal de resta. Salida de la fluorescencia media de cada retorno de la inversión junto con las etiquetas de tiempo. </li><li> Anote el número de flashes en cada uno de los archivos de imagen de escaneo de serie junto con el tiempo de ciclo y el área dela célula. Uso de Excel para calcular la frecuencia de flash como el número de destellos por 100 seg área de la celda / 1000 m 2. </li><li> Utilice un programa personalizado-desarrollado escrito en lenguaje de datos interactivo (IDL, ResearchSystems) para calcular los parámetros de cada destello (amplitud, tiempo hasta el pico y el tiempo de decaimiento). Software IDL está disponible comercialmente y el programa personalizado-desarrollado para el análisis de parámetros de flash se puede obtener de autor a petición. </li></ol>

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Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes.">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Imaging eventos mitocondriales individuales en animales vivos o en los órganos perfundidos tiene ventaja significativa sobre los métodos tradicionales de evaluación de la función mitocondrial 17,19,21,22,24,25. La técnica descrita aquí puede lograr en tiempo real en la determinación in situ de la función mitocondrial en una condición fisiológica real en la resolución subcelular. Esto es particularmente útil, cuando se combina con otras mediciones, para estudiar sistémicamente el...

Las mitocondrias juegan un papel central en la bioenergética celular, la señalización de los radicales libres, la homeostasis redox, la regulación de iones, y la determinación del destino celular 1,2. Las mitocondrias a menudo acompaña a la disfunción y la base de la patogénesis de las enfermedades 3-6. Especialmente en los sistemas musculares tales como el corazón y los músculos esqueléticos, la respiración mitocondrial proporciona la mayoría de ATP para apoyar la regulación oportuna de calcio intracelular y robusto 7,8 desarrollo de la fuerza. Estos músculos poseen un gran número de mitocondrias, que a menudo ocupan hasta un 20-40% del volumen total de células y son &quot;fijos&quot; entre miofilamentos 2. A pesar de numerosos estudios, nuestra comprensión de la regulación de la función mitocondrial, específicamente in vivo y bajo condiciones fisiológicamente pertinentes, es limitada. Una de las razones es que la mayoría de los métodos desarrollados para la evaluación de la función mitocondrial depende de en VITRO o ex enfoques in vivo, tales como el control de la consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas suplementado con sustratos artificiales, y la determinación indirecta de la función mitocondrial a través de la morfología (microscopía de electrones por ejemplo), actividad enzimática (por ejemplo, actividad de la aconitasa), o los niveles de ATP intracelulares 9-11 . Recientemente, los pequeños indicadores fluorescentes de moléculas con un enriquecimiento relativo mitocondrial se han aplicado para proporcionar una visión de las señales mitocondriales, incluyendo el potencial de membrana, calcio y especies reactivas de oxígeno (ROS), en células intactas 11-13. Por otra parte, varios proteína fluorescente verde (GFP) y redox basado en indicadores de ROS se han desarrollado para lograr una evaluación más específica de la redox intracelular de ROS compartimentada o señales de 14-16. Entre esto, hemos desarrollado un indicador codificado genéticamente dismutasa, la proteína amarilla fluorescente circular permutada y targeted en las mitocondrias (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP puede ser excitado a 405 o 488 nm con dos picos de emisión a 515 nm. La emisión a 488 nm de excitación es específicamente sensible a superóxido como se muestra por el anterior in vitro e in vivo calibraciones 17,18. La emisión a 405 nm de excitación se utilizó como control interno (por favor refiérase a la Figura 1 de la Ref. 17 para obtener información detallada sobre la emisión y excitación espectros de mt-cpYFP en diversas condiciones). Con la imagen confocal de lapso de tiempo, este indicador detecta reventar eventos de producción de superóxido, llamados destellos superóxido, en las mitocondrias individuales de células intactas. Flash superóxido sirve como una función compuesta de la respiración mitocondrial, acompañamiento transitoria despolarización de la membrana mitocondrial y la producción de ROS 17-20. Recientemente, hemos generado las pan-tejido mt-cpYFP ratones transgénicos utilizando el vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 en C57/BL6 fondo y verificado las expresiones fuertessión de este indicador en el corazón, los músculos esqueléticos y otros tejidos (Figura 2). Los ratones transgénicos estará disponible para los investigadores académicos interesados ​​previa solicitud y aprobación MTA por la Universidad de Washington. En este estudio, se describe en la formación de imágenes in situ de destellos superóxido en corazón Langendorff perfundidos, así como formación de imágenes in vivo de eventos de flash en los músculos esqueléticos de MT-cpYFP ratones transgénicos anestesiados 17,19. Esta tecnología permite la monitorización en tiempo real de eventos de producción de ROS mitocondriales individuales en un estado fisiológicamente relevante o in vivo 21,22. También es factible utilizar el sistema para controlar otros parámetros mitocondriales individuales tales como el potencial de membrana y de calcio con indicadores fluorescentes apropiados. Evaluación Además, simultánea o paralela de la función mitocondrial con eventos intracelulares (por ejemplo, los transitorios de calcio) o la función del corazón (por ejemplo,. Fracción de eyección) se puede lograr. Perturbaciones patológicas, tales como la isquemia y la reperfusión, se pueden aplicar al corazón perfundido para evaluar el impacto del estrés sobre la función mitocondrial solo en el miocardio intacto.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitocondria es un orgánulo intracelular crítico responsable de la producción de energía y la señalización intracelular en sistemas eucarióticos. La disfunción mitocondrial a menudo acompaña y contribuye a la enfermedad humana. La mayoría de los enfoques que se han desarrollado para evaluar la función mitocondrial y la disfunción se basa en in vitro o in vivo mediciones ex. Los resultados de estos experimentos han capacidad en la determinación de la función mitocondrial in vivo limitado. Aquí se describe un nuevo método que utiliza la microscopía confocal de barrido para la obtención de imágenes de los tejidos intactos en aminales en vivo, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial solo de una manera en tiempo real en vivo. Primero, generamos ratones transgénicos que expresan el indicador dismutasa mitocondrial específica, la proteína fluorescente amarilla permutado circularmente (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiado ratón se fija en un adaptador de fase a medida y las imágenes con lapso de tiempo se toman fesde los músculos esqueléticos expuestas de la extremidad posterior. El ratón se sacrificó y posteriormente el corazón está configurado para perfusión Langendorff con soluciones fisiológicas a 37 ° C. El corazón perfundido se coloca en una cámara especial en la platina del microscopio confocal y se aplica una presión suave para inmovilizar el corazón y suprimir los latidos del corazón inducida artefactos de movimiento. Parpadea superóxido se detectan en tiempo real de imagen confocal en 2D a una frecuencia de un fotograma por segundo. La solución de perfusión puede ser modificado para contener diferentes sustratos de respiración u otros indicadores fluorescentes. La perfusión también se puede ajustar para producir modelos de enfermedades como la isquemia y la reperfusión. Esta técnica es un enfoque único para la determinación de la función de único mitocondria en tejidos intactos e in vivo.

De acuerdo con este protocolo, formación de imágenes in vivo de eventos mitocondriales individuales se puede hacer en los músculos esqueléticos de ratones anestesiados, seguido de formación de imágenes en situ en el corazón perfundido (Figura 1). El ajuste óptimo de las condiciones de formación de imágenes se asegurará de imágenes claras de los tejidos musculares intactas y con resolución única mitocondria (Figura 2). TMRM se utiliza a menudo para verific...

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o<em&gt; En Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K vistas.  University of Washington.  La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas. 

Video: Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Investigación

Biología

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

De neuropéptido Y-pHluorin de la proyección de imagen confocal: una técnica para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en islotes humanos y murinos intactos

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Cuantificación del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

Autor destacado: Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa  

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...