El trabajo realizado en el laboratorio Lécuyer con el apoyo de fondos de la Nacional de Ciencias e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y el Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre y Gaël Moquin-Beaudry son apoyados por NSERC becas de investigación de pregrado, mientras que Carole Iampietro con el apoyo de la beca postdoctoral Pizzagalli Angelo.

1. Sonda de ARN Preparación Resumen: En la siguiente sección se describen los pasos necesarios para hacer digoxigenina (DIG)-etiquetados sondas de ARN para el pescado. El primer paso implica la clonación o la PCR de la secuencia correspondiente a la región transcrita de un gen de interés que se utilizará para generar una sonda específica de secuencia. Esto se puede lograr por clonación primero el segmento de gen en un plásmido en el que está flanqueado el sitio de clonación múltiple por elementos promotores de bacteriófagos (T7, T3 o SP6), que puede entonces servir como una plantilla para PCR usando cebadores flanqueantes que incorporan las secuencias del promotor , generando así un producto de la PCR lineal con secuencias promotoras diferentes en cada extremidad (Figura 1A). Alternativamente, para evitar el paso de clonación, también se puede realizar la amplificación por PCR a partir de ADN genómico o ADNc usando oligonucleótidos que incluyen T7, T3 o SP6 secuencias en sus 5 &#39;extremidades (por ejemplo, T7:5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39; AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3 &#39;; Sp6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3&#39;). Los productos de PCR lineales se utilizan entonces como plantillas para hacer sentido marcada con DIG o sondas de ARN antisentido por escorrentía transcripción in vitro con la polimerasa apropiada (Figura 1B). Al hacer sondas para genes específicos, se recomienda la preparación de tanto sentido y antisentido sondas de ARN usando polimerasas diferentes, que serán útiles para evaluar la especificidad FISH señal (es decir, a menos que el gen de interés se transcribe en la orientación antisentido, la sonda de ARN sentido revelará la nivel de señal de fondo). En todos estos pasos, se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación potencial de contaminantes ribonucleasas (RNasas) por la primera limpieza todas las áreas del banco y el equipo con el 70% de etanol o soluciones comerciales de descontaminación RNAsa y usando RNasa libre de los suministros (agua, puntas, tubos de microcentrífuga). Mamáriales <ul><li> Tubos de 1,5 ml de centrífuga, (Abgene, Rochester, NY, EE.UU. cat. No 0900) </li><li> Extracción de gel kits (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá. Cat. No. 28.706). </li><li> RNasa libre de agua (Wisent, Cat Inc.. º 809-115-CL) </li><li> ARN polimerasas (T7, T3 o SP6). (20 U / l, Fermentas Biosciences. Cat. No. EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAsa-OUT inhibidores de ribonucleasas (40 U / l), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019). </li><li> Digoxigenina (DIG) mezclas de nucleótidos (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canadá. Cat. No.11209256910). </li></ul> Equipo <ul><li> Tablero micro-centrífuga </li><li> La electroforesis en gel aparato </li></ul><ol><li> Amplificar por PCR de genes específicos de secuencia de ADN genómico, ADNc o ADN de plásmido lineal para generar un producto de PCR flanqueado por el bacteriófago T7, secuencias promotoras T3 o SP6. Seguir las recomendaciones del fabricante para las condiciones de PCR. </li><li> Verificar la calidad y size del producto de PCR por electroforesis en gel de agarosa. Impuestos Especiales y purificar el producto de PCR usando un patrón de gel-kit de extracción de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y eluir el producto en 50 l de tampón. </li><li> Se precipita el producto de la PCR mediante la adición de 5 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 150 l de etanol enfriado con hielo 100%, y se colocan los tubos a -70 ° C durante la noche. Centrifugar los tubos a 13.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se lava el precipitado con etanol al 70%. Girar de nuevo, quite todos los restos de etanol y secar la pastilla. Resuspender en 25-50 l de RNasa libre de agua. </li><li> Transcribir marcada con DIG sonda usando 200-500 ng producto de PCR purificado en una reacción de 20 l de la siguiente manera: 2 l de tampón 10X de la transcripción T7 (Invitrogen), 1 l (20 U / l) de inhibidor de RNasa, 2 l Dig-NTP mix , y 2 l T7 RNA polimerasa (20 U / l). Llevar el volumen final a 20 ml con agua libre de RNasa. Incubar la reacción de transcripción a 37 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Ajuste transcription mezcla a 50 ml con RNasa libre de agua y precipitar la Dig-etiquetados sonda de ARN, como se describe en el Paso 4. Resuspender el sedimento lavado de ARN en 100 l de RNasa libre de agua. Almacenar las muestras se resuspendieron a -70 ° C. </li><li> Cuantificar la sonda usando un espectrofotómetro NanoDrop. Para verificar la calidad de la sonda, ejecutar un ejemplo de 1-2 l en un gel teñido con 1-2% de agarosa con bromuro de etidio. </li></ol> 2. Obtención y fijación de embriones de Drosophila Resumen: En este apartado se describen los pasos para la recolección y procesamiento de escena embrión de Drosophila. Dependiendo del número de embriones necesarios, las moscas pueden ser mantenidos en jaulas de población de diversos tamaños. Los pasos siguientes son para las colecciones realizó con 900 cm 3 jaulas cilíndricas de 100 mm con placas de recolección de manzanas jugo. La fijación correcta requiere la eliminación de dos capas protectoras que rodean el embrión: el corion exterior y el interior vitelinae membrana 13. Una vez recogidas, los embriones son primero bañado en una solución de lejía al 50% para eliminar el corion, a continuación, se mezclan en una solución bifásica que contiene heptano (permeabiliza la membrana vitelina), y PBS que contenía 3,7% de formaldehído. La membrana vitelina es entonces agrietado y eliminado mediante la transferencia de los embriones en una mezcla bifásica de heptano y metanol. Fijación embrión apropiado y la eliminación de la membrana vitelina es crítico para el éxito del procedimiento FISH aguas abajo. Materiales <ul><li> Zumo de manzana placas de agar (40% de zumo de manzana, 4% de sacarosa, 3,5% de agar, 0,3% de metil parabeno) con pasta de levadura tamaño de una moneda (levadura de panadería se mezcla con agua a la consistencia de mantequilla) </li><li> Paraformaldehído en polvo (Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA, USA,. Cat. N º 19208) </li><li> Heptano </li><li> Metanol </li><li> 3% de lejía solución </li><li> 20 ml de cristal de centelleo viales (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá. Cat. No. 03-337-15). </li></ul> Equipo <ul><li> Jaulas de población </li><li> Cestas de la colección (hecha utilizando una malla Nitex y la parte superior de un corte 50 ml en tubo de polipropileno que ha sido un agujero practicado en la tapa). </li><li> Pincel pequeño </li><li> Tablero vórtice </li></ul><ol><li> Pre-claras bien alimentados jaulas de población con una manzana fresca zumo / levadura placa durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Añadir un nuevo zumo de manzana / levadura placa a la caja para recolectar embriones prematuros. Incubar la jaula durante 4 horas a 25 ° C (nota que los tiempos de recogida se puede ajustar en función de las etapas deseadas). </li><li> Preparar una nueva solución de formaldehído al 37% mediante la combinación de polvo de 3,7 g de paraformaldehído, 70 l de KOH 2N, y 7,3 ml de agua MilliQ en un vial de centelleo de vidrio bajo una campana química. Hervir la solución hasta que el polvo de paraformaldehído se disuelve completamente, luego se enfría a temperatura ambiente y se filtra en un vial de centelleo de nuevo. </li><li> Prepare una solución de fijación bifásica porcombinando 2,25 ml de 1X PBS con 250 ml de formaldehído al 37% en un vial de centelleo, y luego la adición de 7,5 ml de heptano. </li><li> Se recoge el jugo de manzana placa de la jaula y recoger los embriones mediante la adición de un poco de agua del grifo a temperatura ambiente y delicadamente cepillado de los embriones de la placa con el pincel. Transferir los embriones resuspendidas en una cesta y enjuagar con agua corriente tibia. </li><li> Dechorionate embriones durante 90 segundos por bañando las cestas de recolección en una solución de lejía, luego enjuague bien con agua corriente tibia (hasta que el olor a blanqueador desaparezca). </li><li> Desmontar la canasta de la colecta, recoger embriones suavemente con un pincel y transferirlos a la solución de fijación bifásica. Los embriones se acumulan en la interfase entre el PBS y las capas de heptano. </li><li> Seal viales de centelleo y se fije a un mezclador de vórtice. Agitar durante 20 min en el ajuste más bajo. </li><li> Retirar y desechar la mayoría de las fases inferiores PBS y superior heptano utilizando una pipeta Pasteur. Aspirarel restante PBS / heptano / embriones mezcla en la pipeta. Gota a gota, desechar la fase inferior PBS de la pipeta, teniendo cuidado de no eliminar los embriones. Depositar los embriones en un tubo de 1,5 ml que contiene una solución bifásica de 500 l de heptano (fase superior) y 500 l de metanol (fase inferior). </li><li> Agitar los tubos vigorosamente a mano durante 30-45 segundos para romper las membranas vitelina. Una vez roto, los embriones se hundirá en el metanol. </li><li> Descartar la fase superior heptano y embriones no agrietados en la interfase heptano / metanol, y se añaden 500 l de metanol. Agitar durante 5 seg. </li><li> Lavar 3 veces con metanol y almacenar los embriones a -20 º C (en este punto los embriones pueden ser almacenados por semana / mes). </li></ol> 3. Fijación post-proceso, la hibridación y Post-hibridación lavados Resumen: Esta sección detalla los pasos de proceso de permeabilización embrión antes de FISH, pre-hibridación,la hibridación con las sondas de ARN y lavados post-hibridación. Para los pasos iniciales de permeabilización de los embriones se tratan como una piscina en un solo tubo (pasos 1-9 a continuación, con el objetivo de 10-15 l de embriones asentados / muestra), pero se dividieron en alícuotas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos PCR antes de proceder con la etapa de pre-hibridación (paso 10 a continuación). Esto ayuda a asegurar incluso el tratamiento de todos los embriones en las fases iniciales del experimento. Al configurar un experimento FISH, es importante incluir controles negativos para determinar el nivel de señal de fondo en los experimentos individuales. Para ello, se recomienda incluir una muestra de &#39;no-sonda &quot;y, como se señaló en la sección 1, la muestra se hibridó con el&quot; sentido &quot;de la sonda de ARN, que por lo general le dará una señal comparable a la condición de« no-sonda &quot;. Materiales: <ul><li> Metanol </li><li> Salina tamponada con fosfato con 0,1% de Tween-20 (PBT) </li><li> Proteinasa-K 1 mg / ml de solución madre (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canadá. N º de catálogo P2308) </li><li> Glicina (20 mg / ml de solución madre) </li><li> Solución de hibridación: 50% formamida, 5 x SSC, 0,1% de Tween-20, 100 g / ml de ADN de esperma de salmón, 100 ug / ml de heparina. </li><li> 0,2 ml halfskirted 96-y placas PCR, ABgene, Rochester, NY, Gato EE.UU.. No 0900) </li></ul> Equipo <ul><li> Baño de horno de hibridación, bloque de calentamiento de agua digital o ajustable a 56 ° C, 80 ° C o 100 ° C, o una máquina de PCR. </li><li> Pipetas multicanal (recomendado para simplificar los procesos de lavado) </li><li> Mezclador oscilante </li></ul><ol><li> Enjuagar los embriones en metanol, a continuación, en una mezcla 1:1 de metanol: PBT, y luego dos veces en PBT. </li><li> Fijar los embriones durante 20 minutos en 1 ml de PBT que contiene 3,7% de formaldehído (recién preparado como se describe en el paso 11) con agitación constante en un Nutator. </li><li> Lavar los embriones durante 3 veces durante 2 min en PBT mientras se balancea. </li><li> Preparar una solución de 3 mg / ml de proteinasa K (PK) diluido en PBT y añadir500 l de solución a las muestras. Incubar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente sin agitación. Mezclar embriones cada 2 min por chorro con una pipeta o invirtiendo suavemente los tubos. </li><li> Transferir las muestras embriones en hielo durante 1 hr. </li><li> Mover las muestras a temperatura ambiente y eliminar la solución PK. Lavar 2 veces durante 2 min con 1 ml de PBT + 2 mg / ml de glicina. </li><li> Fijar las muestras de 20 min en 1 ml de formaldehído PBT + 3,7% con agitación. Enjuague embriones 5 veces en PBT. </li><li> Enjuague embriones con 1 ml de una mezcla 1:1 de PBT y solución Hyb. Reemplazar con 0.5-1 ml de 100% de solución de hibridación (en este paso los embriones se pueden almacenar durante varios días / semana a -20 ° C). </li><li> Embriones alícuotas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (objetivo de ~ 10-15 l de embriones asentados / pocillo, tenga cuidado de utilizar puntas de gran apertura para evitar dañar los embriones). </li><li> Hervir 100 l / muestra de la solución de hibridación durante 5 minutos y luego se enfría en hielo durante 5 min. Esta solución se utiliza para la muestra de pre-hibridación (Pre-Hyb). </li><li> Añadir 100 l / muestra de Pre-Hyb solución e incubar durante al menos 2 horas a 56 ° C. </li><li> Para cada muestra, diluir ~ 100 ng de la sonda en 100 l de solución de hibridación. Se calienta a 80 ° C durante 3 min, a continuación, enfriar en hielo durante 5 min (sondas calentadas se pueden mantener en hielo durante varias horas). </li><li> Retire la solución de pre-hibridación de los embriones y reemplazarla con la solución de la sonda de ARN. </li><li> Hibridar a 56 º C durante 12-16 h. </li><li> Calentar las soluciones de lavado siguientes a 56 ° C: (A) 200 l / muestra de la solución de hibridación; (B) 100 l / muestra de una mezcla 3:1 de Hyb: PBT; (C) 100 l / muestra de un mezcla 1:1 de Hyb: PBT; (D) 100 l / muestra de una mezcla 1:3 de Hyb: PBT; (E) 400 l / muestra de PBT. </li><li> Enjuague muestras con 100 l de solución de lavado A, a continuación, realizar la etapa de lavado con 100 l / muestra de AD soluciones a 56 ° C durante 15 min cada uno. A continuación, lavar las muestras 4 veces durante 5 min con 100 l / muestra de la solución E a 56 ° C. </li><li> Enfriar las muestras a temperatura ambiente. </li></ol> Información general: Esta sección describe los anticuerpos y reactivos de detección utilizados para detectar y visualizar la distribución de la señal de hibridación sonda de ARN siguiente. Estos pasos se describen esquemáticamente en la Figura 2. Aquí sólo se presentan los reactivos de detección estándar que utilizamos para la amplificación de la señal robusta, pero existe una variedad reactivos comercialmente disponibles que pueden ser utilizados como alternativas, especialmente cuando se realizan experimentos de FISH de doble para co-detectar RNAs diferentes al mismo tiempo para la proteína-ARN de doble tinción. Ejemplos de resultados obtenidos con este protocolo se muestran en el patrón de expresión mRNA mosaico / localización en la Figura 3. Materiales <ul><li> HRP-conjugado monoclonal de ratón anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. No. 200-032-156) </li><li> Biotina conjugada con anticuerpo monoclonal de ratón anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratorios Cat Inc.. N º 200-062-156) </li><li> Estreptavidina-HRP conjugado (Molecular Probes, Eugene, USA, cat. No.S991) </li><li> Cy3-tiramida conjugados (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, EE.UU., cat. No. SAT704A) </li><li> DABCO solución de montaje: En un tubo de 50 ml, diluir 1,25 gramos de DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano; Sigma D-2522) en 15 ml de 1X PBS, a continuación, añadir 35 ml de glicerol y se mezcla hasta que esté totalmente homogénea. Mezclando previamente con PBS, el polvo de DABCO se disuelve muy rápidamente. Tienda de montaje solución a -20 ° C. </li><li> Portaobjetos de vidrio, cubreobjetos </li></ul> Equipo <ul><li> Mezclador oscilante </li><li> Multichannel pipeta </li><li> Microscopio de fluorescencia </li></ul><ol><li> Preparar la solución de PBTB, que contiene PBT + 1% de leche sin grasa seca (normalmente 50-100 ml es suficiente para toda la incubación del reactivo de detección y los pasos de lavado). </li><li> Bloquear las muestras durante 10 min a temperatura ambiente en 100 PBTB mu l / muestra, mientras que el balanceo en Nutator. </li> &lt;li&gt; Retirar la solución de bloqueo a partir de embriones y las muestras se incuban durante 1.5-2 horas a temperatura ambiente con 100 l / muestra de la solución de anticuerpo monoclonal anti-biotina DIG (diluido 1/400 en stock en PBTB) con agitación. </li><li> Lavar las muestras de 6 veces durante 5 minutos cada uno con 100 PBTB l / muestra con balanceo. </li><li> Incubar 1,5 hr a temperatura ambiente con 75 ml / muestra de estreptavidina-HRP solución (diluido 1/100 de almacén, en PBTB, 10 mg / ml de concentración final) con agitación. </li><li> Lavar las muestras de 6 veces durante 5 min cada uno. PBTB 100 l / muestra con balanceo (para la contratinción ADN, DAPI diluir a 1X concentración de trabajo en PBTB y usar esta solución en la primera etapa de lavado) </li><li> Enjuague embriones con PBT, luego lavar 2 veces durante 5 min con PBS. </li><li> Incubar las muestras durante 2 horas a temperatura ambiente en la Nutator con 50 l / muestra de Cy3-tiramida solución (diluido 1/50 en tampón de amplificación tiramida). Partir de este paso, asegúrese de mantener las muestras en un recipiente ligero blindado. &lt;/ Li&gt; <li> Lavar las muestras de 6 veces durante 5 minutos cada uno con 100 l de PBS / muestra en Nutator. </li><li> Retirar PBS y añadir 100-125 l / muestra de la solución de montaje que contiene 70% de glicerol y 2,5% (DABCO). Almacene las muestras a 4 ° C. Estas muestras se pueden almacenar durante varios años. </li><li> Utilizando una punta de gran calibre, resuspender los embriones pipeteando con suavidad las muestras y transferir 25 l de embriones en un portaobjetos de vidrio, coloque un cubreobjetos sobre los embriones y el sello en la diapositiva con esmalte de uñas. </li><li> Analizar las muestras de embriones utilizando un microscopio de fluorescencia. </li></ol>

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Para ver los pasos de síntesis de la sonda, que suelen generar escorrentía antisentido sondas de ARN por transcripción in vitro de larga duración cDNAs amplificados a partir de plásmidos de Drosophila se encuentran en la Colección de Drosophila Gene (DGC), un recurso detalla en la siguiente dirección: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http:// .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente en estud...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> T7, la ARN polimerasa T3 o SP6 </td><td> Fermentas Ciencias de la Vida </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Los kits contienen tampón de reacción. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato sódico 3 M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol frío al 100%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol frío al 70%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de lejía diluida 1:1 con agua. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinasa K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canadá </td><td> N º de catálogo P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% solución de formaldehído, recién preparado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween solución (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% de Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina solución </td><td></td><td> 2 mg / ml de glicina en PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-conjugado monoclonal de ratón anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre en PBTB </td></tr><tr><td> HRP de oveja conjugado monoclonal anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> Dilución 1/500 de la solución madre en PBTB </td></tr><tr><td> Biotina conjugada con anticuerpo monoclonal de ratón anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EE.UU. </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre en PBTB </td></tr><tr><td> Estreptavidina-HRP conjugado </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, EE.UU. </td><td> S991 </td><td> (1/100 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Evaluar el patrón de expresión de un gen, así como las propiedades de localización subcelular de sus ARN transcrito, son características clave para la comprensión de su función biológica durante el desarrollo. ARN hibridación in situ (ISH-RNA) es un poderoso método utilizado para la visualización de las propiedades de ARN de distribución, ya sea a nivel organismal, celular o subcelular 1. ARN-ISH se basa en la hibridación de una sonda de ácido nucleico marcada (por ejemplo, ARN antisentido, oligonucleótidos) complementaria a la secuencia de un ARNm o un objetivo no codificante de ARN de interés 2. A medida que el procedimiento requiere información de la secuencia primaria por sí sola para generar sondas específicas de secuencia, que puede aplicarse universalmente a una amplia gama de organismos y muestras de tejido 3. De hecho, un número de estudios a gran escala ISH se han implementado para documentar la expresión génica y ARN dinámica de localización en diversos organismos modelo, que ha llevado a laestablecimiento de recursos comunitarios importantes 4-11. Mientras que una variedad de la sonda de etiquetado y estrategias de detección se han desarrollado a lo largo de los años, el uso combinado de los reactivos de detección marcadas con fluorescencia y enzimáticas pasos de amplificación de señal ofrecen mejoras significativas en la sensibilidad y la resolución del procedimiento 12. A continuación, describimos un fluorescente optimizado método de hibridación in situ (FISH) utilizando amplificación de la señal tiramida (TSA) para visualizar la expresión del ARN y la dinámica de localización en una puesta de embriones de Drosophila. El procedimiento se lleva a cabo en 96-y formato de placa de PCR, lo que facilita en gran medida el procesamiento simultáneo de grandes números de muestras.

Si se realiza con éxito, este procedimiento ofrece un nivel notablemente mejorada de detalle en el análisis espacio-temporal de la expresión génica y la dinámica de localización de mRNA a principios de la embriogénesis de Drosophila. En efecto, como se ilustra en la Figura 3 para el más pequeño de genes clásico par-rule (pista), se puede usar este protocolo para observar eventos de expresión génica a través de la detección de focos de transcripci...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación (FISH) protocolo para determinar las propiedades de expresión y localización de ARN expresados ​​durante la embriogénesis en la mosca de la fruta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K vistas.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje In situ Hibridación (FISH) protocolo para determinar las propiedades de expresión y localización de ARN expresados ​​durante la embriogénesis en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster.

Video: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...