Trabalho realizado no laboratório Lecuyer é suportado por financiamento do Conselho Nacional e Ciências da Engenharia do Canadá (NSERC), o Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e do Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre e Gaël Moquin-Beaudry são suportados por NSERC bolseiros de iniciação científica, enquanto Carole Iampietro é suportado pela irmandade Pizzagalli Angelo pós-doutorado.

1. Preparação da sonda de ARN Resumo: A seção seguinte descreve os passos necessários para fazer sondas digoxigenina (Dig)-rotulados de RNA suficiente para os peixes. O primeiro passo envolve a clonagem ou PCR amplificar uma sequência correspondente à região transcrita de um gene de interesse que irá ser utilizado para gerar uma sonda específica da sequência. Isto pode ser conseguido por clonagem do primeiro segmento de gene em um plasmídeo no qual o sítio de clonagem múltipla é flanqueado por elementos do promotor de bacteriófago (T7, T3 ou SP6), que pode então servir como um modelo para PCR, utilizando iniciadores que flanqueiam que incorporam as sequências de promotor , gerando um produto de PCR linear com as sequências promotoras diferentes, em cada extremidade (Figura 1A). Alternativamente, a fim de evitar o passo de clonagem, pode-se também realizar a amplificação por PCR a partir de DNA genómico ou de ADNc, utilizando oligonucleótidos que incluem T7, T3 ou SP6 nas suas sequências 5 &#39;extremidades (por exemplo T7:5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; Sp6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). Os produtos de PCR lineares são então utilizados como modelos para fazer sentido Dig-rotulado ou sondas de RNA anti-sentido, através do escoamento de transcrição in vitro com a polimerase apropriada (Figura 1B). Ao fazer sondas para genes específicos, recomendamos a preparação tanto sentido e as sondas de RNA anti-sentido utilizando polimerase distintas, que serão úteis para avaliar a especificidade FISH sinal (isto é, a menos que o gene de interesse é transcrito na orientação anti-sentido, o sentido de RNA sonda irá revelar o nível de sinal de fundo). Em todas as etapas a seguir, deve-se tomar muito cuidado para evitar a degradação potencial por ribonucleases contaminantes (ARNases) pela primeira limpeza de todas as áreas de banco e equipamentos com etanol 70% ou soluções de descontaminação comerciais RNase e usando RNase suprimentos (água, por exemplo, dicas, tubos de microcentrífuga). Mamãeriais <ul><li> 1,5 ml tubos de microcentrífuga, (ABgene, Rochester, NY, EUA Cat. No 0900) </li><li> Gel de extração de kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canadá;. Cat. 28706). </li><li> RNAse água (Wisent, Cat Inc. º. 809-115-CL) </li><li> Polimerases de ARN (T7, T3, ou SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences cat.. No. EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAse-OUT inibidores de ribonucleases (40 U / ul), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019). </li><li> Digoxigenina (DIG) misturas de nucleotídeos (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, Quebec, Canadá. Gato. No.11209256910). </li></ul> Equipamento <ul><li> Tampo micro centrífuga- </li><li> Electroforese em gel aparelho </li></ul><ol><li> PCR amplificar gene específico da sequência de DNA genómico, cDNA, ou DNA de plasmídeo para gerar um produto de PCR linear flanqueado pelo bacteriófago T7, T3 ou sequências de promotor SP6. Seguir as recomendações do fabricante para as condições de PCR. </li><li> Verificar a qualidade ea size do produto de PCR por electroforese em gel de agarose. Especial e do produto de PCR purificar utilizando um kit de extracção de gel-padrão de acordo com a fabrica recomendações e eluir o produto em 50 ul de tampão. </li><li> Precipitar o produto de PCR por adição de 5 jul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 150 ul de etanol a 100% arrefecido em gelo, e coloque os tubos a -70 ° C durante a noite. Centrifugar os tubos a 13.000 xg durante 10 min a 4 ° C e lava-se o sedimento com etanol a 70%. Girar novamente, remover todos os vestígios de etanol e secar o sedimento. Ressuspender em 25-50 ul de ARNase isento de água. </li><li> Transcrever Dig-sonda marcada com 200-500 ng produto de PCR purificado numa reacção de 20 uL da seguinte forma: 2 ul de tampão 10X de transcrição de T7 (Invitrogen), 1 ul (20 U / ul) de inibidor de RNAse, 2 ul de mistura de Dig-NTP e 2 ul de ARN-polimerase de T7 (20 U / ul). Trazer o volume final de 20 ul com água livre de RNAse. Incubar a reacção de transcrição a 37 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Ajuste transcription mistura a 50 ul com água livre de RNAse e precipitar o Dig-rotulado sonda de ARN, tal como descrito no Passo 4. Ressuspender o pellet lavado RNA em 100 ul de RNAse-livre de água. Armazenar as amostras ressuspensas a -70 ° C. </li><li> Quantificar a sonda usando um espectrofotômetro NanoDrop. Para verificar a qualidade da sonda, executar uma amostra 1-2 ul em 1-2 manchado gel de agarose% com brometo de etídio. </li></ol> 2. Recolha e fixação de embriões de Drosophila Resumo: Esta seção descreve as etapas para colheita e processamento encenado embrião de Drosophila. Dependendo do número de embriões necessários, as moscas podem ser mantidos em gaiolas de população de vários tamanhos. Os passos seguintes são para coleções realizada utilizando 900 centímetros 3 gaiolas cilíndricas usando 100 milímetros maçã placas de coleta de suco. Fixação adequada requer a remoção de duas camadas de protecção em torno do embrião: o cório exterior e o interior vitelinae membrana 13. Uma vez colhido, os embriões são primeiro banhado com uma solução de lixívia a 50% para remover o cório, em seguida, são misturados com uma solução bifásica contendo heptano (permeabilizes a membrana vitelina), e PBS contendo formaldeído a 3,7%. A membrana vitelina é então quebrado e removido através da transferência dos embriões em uma mistura bifásica de heptano e metanol. Fixação embrião propriamente dito e a remoção da membrana vitelina é crítico para o sucesso do procedimento FISH jusante. Materiais <ul><li> Sumo de maçã placas de agar (40% de sumo de maçã, de 4% de sacarose, 3,5% de ágar, 0,3% de metil-parabeno) com dime-sized pasta de levedura (levedura de padeiro misturado com água até uma consistência de manteiga) </li><li> Paraformaldeído em pó (Ciências da microscopia eletrônica, Hatfield, PA, EUA,. Cat n ​​º 19.208) </li><li> Heptano </li><li> Metanol </li><li> Solução Bleach 3% </li><li> 20 ml de vidro de cintilação frascos (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá;. Cat No. 03-337-15). </li></ul> Equipamento <ul><li> Gaiolas população </li><li> Cestos de recolha (feito usando uma malha Nitex e a parte de cima de um corte de tubos de polipropileno de 50 ml, em que um furo tenha sido cortada na tampa). </li><li> Pincel pequeno </li><li> Vórtice de mesa </li></ul><ol><li> Pré-claras bem alimentados gaiolas população com uma maçã fresca placa suco / levedura durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Adicionar um novo prato de maçã suco / levedura para a gaiola para a colheita de embriões em fase inicial. Incubar a gaiola durante 4 hr a 25 ° C (note que os tempos de recolha pode ser ajustado dependendo das fases desejadas). </li><li> Prepara-se uma solução de formaldeído a 37% fresco, combinando 3,7 g de paraformaldeído em pó, 70 ul de KOH 2N e 7,3 ml de milliQ água num frasco de cintilação de vidro sob uma coifa química. Ferve-se a solução até que o paraformaldeído em pó esteja completamente dissolvido, e depois arrefecer até à temperatura ambiente e filtrar para frasco de cintilação de novo. </li><li> Prepare uma solução de fixação por bifásicacombinando 2,25 ml de 1X PBS com 250 ml de formaldeído a 37% num frasco de cintilação, em seguida, adicionando 7,5 ml de heptano. </li><li> Colher da placa de sumo de maçã da gaiola e recolher os embriões através da adição de um pouco de água da torneira temperatura ambiente e delicadamente escovar os embriões fora da placa com o pincel. Transferir os embriões ressuspensos em uma cesta e enxágüe com água morna da torneira. </li><li> Embriões Dechorionate para 90 seg banhando as cestas de coleta em solução de água sanitária, em seguida, enxaguar com água morna da torneira (até lixívia cheiro se foi). </li><li> Desmonte a cesta coleta, coletar embriões delicadamente usando um pincel e transferi-los para a solução de fixação bifásico. Os embriões vai acumular na interface entre a camada de heptano e PBS. </li><li> Selo de cintilação frascos e prenda a um misturador de vórtice. Agitar durante 20 minutos na configuração mais baixa. </li><li> Remover e descartar a maior parte das fases inferiores e superiores de PBS heptano, usando uma pipeta de Pasteur. Aspirara mistura de PBS / heptano / embriões restantes para a pipeta. Gota a gota, rejeitar a fase inferior PBS da pipeta, tendo o cuidado de não eliminar os embriões. Depositar os embriões para um tubo de 1,5 ml contendo uma solução bifásica de 500 ul de heptano (fase superior) e 500 uL de metanol (fase inferior). </li><li> Agite vigorosamente os tubos com a mão por 30-45 seg para quebrar as membranas vitelínicos. Uma vez rachado, os embriões vai afundar o metanol. </li><li> Descarte a fase superior de heptano e embriões uncracked na interfase heptano / metanol e adicionar 500 ul de metanol. Agitar durante 5 seg. </li><li> Lavar 3 vezes com metanol e armazenar os embriões a -20 ° C (neste ponto os embriões podem ser armazenados por semana / mês). </li></ol> 3. Pós-fixação Lava hibridação, Processamento e Pós-hibridação Resumo: Esta seção detalha as etapas de processamento para permeabilização embrião antes da FISH, hibridação pré-hibridação com as sondas de RNA e de pós-hibridação lavagens. Para os passos iniciais permeabilização os embriões são tratados como um conjunto de um único tubo (passos 1-9 a seguir, a fim de 10-15 ul de embriões assentadas / amostra), mas eles são aliquotadas em poços individuais de uma placa de PCR de 96 poços antes de prosseguir com o passo de pré-hibridação (passo 10). Isso ajuda a garantir um tratamento de todos os embriões nas fases iniciais do experimento. Quando da criação de uma experiência FISH, é importante incluir controlos negativos para determinar o nível de sinal de fundo em experiências individuais. Por isso, recomendamos incluindo amostra de um &quot;não-sonda e, como mencionado na seção 1, uma amostra hibridizada com o&quot; sentido &quot;RNA sonda, que normalmente dão um sinal comparável à condição de o&quot; não-sonda. Materiais: <ul><li> Metanol </li><li> Salina tamponada com fosfato com 0,1% de Tween-20 (PBT) </li><li> Proteinase-K 1 mg / ml de solução-mãe (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canadá. Catalog No. P2308) </li><li> Glicina (20 mg / ml de solução stock) </li><li> Solução de hibridação: 50% de formamida, 5X SSC, 0,1% de Tween-20, 100 g / ml de DNA de esperma de salmão, 100 Heparina ug / ml. </li><li> 0,2 ml halfskirted placas de 96 poços de PCR, ABgene, Rochester, NY, EUA gato. Não 0900) </li></ul> Equipamento <ul><li> Forno de hibridização, o bloco de aquecimento digital ou banho de água ajustável para 56 ° C, 80 ° C ou 100 ° C, ou de uma máquina de PCR. </li><li> Pipetas multicanal (recomendado para simplificar as etapas de lavagem) </li><li> Nutação misturador </li></ul><ol><li> Enxaguar os embriões em metanol, seguida de uma mistura de 1:1 de metanol: PBT, e depois duas vezes em PBT. </li><li> Fixar os embriões, durante 20 min em 1 ml de PBT contendo formaldeído 3,7% (preparada de fresco tal como descrito no passo 11) com agitação constante num Nutator. </li><li> Lavar os embriões por 3 vezes durante 2 minutos em PBT enquanto agitando. </li><li> Prepara-se uma solução de 3 | ig / ml de proteinase K (PK) diluído em PBT e adicionar500 ul de solução de amostra. Incubar as amostras durante 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Misturar embriões cada 2 min por jacto com uma pipeta ou invertendo suavemente os tubos. </li><li> Transferir amostras de embriões em gelo durante 1 hr. </li><li> Mover as amostras à temperatura ambiente e remover a solução de PK. Lavar 2 vezes, durante 2 min com 1 ml de PBT + 2 mg / ml de glicina. </li><li> Fixar as amostras de 20 min em 1 ml de formaldeído PBT + 3,7%, com agitação. Enxaguar embriões 5 vezes em PBT. </li><li> Enxaguar os embriões com 1 ml de uma mistura 1:1 de solução de PBT e Hyb. Substituir com 0,5-1 ml de solução 100% Hyb (nesta etapa, os embriões podem ser armazenados durante vários dias / semanas a -20 ° C). </li><li> Embriões alíquotas em poços individuais de uma placa de 96 poços (objectivo para ~ ul 10-15 de embriões assentados / bem, ter o cuidado de usar dicas de grande abertura para evitar danificar os embriões). </li><li> Ferver 100 ul / amostra de solução de Hyb durante 5 minutos e depois arrefece-se em gelo durante 5 min. Esta solução é utilizada para a amostra de pré-hibridação (pré-Hyb). </li><li> Adicionam-se 100 ul / amostra de pré-Hyb solução e incubar durante pelo menos 2 horas a 56 ° C. </li><li> Para cada amostra, dilua ~ 100 ng de sonda em 100 ul de solução de Hyb. Aquece-se a 80 ° C durante 3 min, depois arrefece-se em gelo durante 5 min (sondas aquecidas pode ser mantida em gelo durante várias horas). </li><li> Remover a solução de pré-Hyb dos embriões e substituir com a solução de sonda de RNA. </li><li> Hibridizar a 56 ° C durante 12-16 hr. </li><li> Pré-aquecer as seguintes soluções de lavagem a 56 ° C: (A) 200 ul / amostra de solução de Hyb, (B) 100 ul / amostra de uma mistura de 3:1 de Hyb: PBT, (C) ul 100 / amostra de um 01:01 mistura de Hyb: PBT, (D) 100 ul / amostra de uma mistura de 1:3 de Hyb: PBT, (E) 400 ul / amostra de PBT. </li><li> Enxaguar as amostras com 100 uL de solução de lavagem A, em seguida, executar o passo de lavagem com 100 ul / amostra de AD soluções a 56 ° C durante 15 minutos cada. Em seguida, lava-se amostras de quatro vezes durante 5 min com 100 ul / amostra de solução E, a 56 ° C. </li><li> Amostras arrefecer à temperatura ambiente. </li></ol> Visão geral: Esta secção descreve os anticorpos e reagentes de detecção utilizados para a detecção e a visualização da distribuição do sinal de hibridação de sonda de ARN a seguir. Estes passos estão descritos de forma esquemática na Figura 2. Aqui nós apresentamos apenas os reagentes de detecção normalizados que utilizamos para a amplificação do sinal robusto, mas existe uma variedade de reagentes disponíveis comercialmente, que podem ser utilizados como alternativas, especialmente quando realizar FISH dupla experiências de co-detectar RNAs diferentes simultaneamente para a proteína-RNA duplo coloração. Exemplos de resultados obtidos com este protocolo são mostrados no padrão de mosaico mRNA expressão / localização na Figura 3. Materiais <ul><li> HRP conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. No. 200-032-156) </li><li> A biotina conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. gato. Não. 200-062-156) </li><li> Estreptavidina-HRP (Molecular Probes, Eugene OR, EUA, cat. No.S991) </li><li> Cy3-tiramida conjugados (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA, Gato. Não. SAT704A) </li><li> DABCO solução de montagem: Num tubo de 50 ml, diluir 1,25 gramas de DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano, Sigma D-2522) em 15 ml de 1X PBS, em seguida, adicionar 35 ml de glicerol e mistura até que esteja totalmente homogênea. Por pré-mistura com PBS, o pó é dissolvido DABCO muito rapidamente. Solução de loja de montagem à temperatura de -20 ° C. </li><li> Lâminas de vidro, lamínulas </li></ul> Equipamento <ul><li> Nutação misturador </li><li> Pipetador multicanal </li><li> Microscópio de fluorescência </li></ul><ol><li> Prepare PBTB solução, contendo PBT + 1% de leite seco não gordo (normalmente 50-100 ml é suficiente para todas incubação do reagente de detecção e as etapas de lavagem). </li><li> Bloquear as amostras durante 10 min à temperatura ambiente em 100 PBTB ul / amostra, enquanto agitando na Nutator. </li> &lt;li&gt; Remover solução de bloqueio a partir de embriões e as amostras a incubar durante 1,5-2 horas à temperatura ambiente com 100 ul / amostra monoclonal biotina da solução de anticorpo anti-DIG (diluído a 1/400 de estoque em PBTB) com agitação. </li><li> Lave as amostras 6 vezes durante 5 minutos cada uma com 100 PBTB ul / amostra, com agitação. </li><li> Incubar 1,5 h à temperatura ambiente com 75 ml / amostra de solução de estreptavidina-HRP (diluído a 1/100 de estoque em PBTB, 10 ug / ml de concentração final), com agitação. </li><li> Lave as amostras 6 vezes durante 5 minutos cada. PBTB 100 ul / amostra com agitação (para a contracoloração DNA, diluir DAPI a concentração 1X trabalhando em PBTB e usar esta solução no passo de lavagem primeiro) </li><li> Enxaguar embriões com PBT, em seguida, lavar duas vezes durante 5 min com PBS. </li><li> Incubar as amostras durante 2 horas à temperatura ambiente no Nutator com 50 ul / amostra de Cy3-tiramida solução (diluído a 1/50 em tampão de amplificação tiramida). A partir deste passo, certifique-se para manter as amostras em um recipiente blindado luz. &lt;/ Li&gt; <li> Lave as amostras 6 vezes durante 5 minutos cada um com 100 ul de PBS / amostra em Nutator. </li><li> Remover PBS e adicionar 100-125 ul / amostra de solução de montagem contendo glicerol a 70% e 2,5% (DABCO). Armazenar as amostras a 4 ° C. Estas amostras podem ser armazenadas durante vários anos. </li><li> Utilizando uma ponta de grande calibre, ressuspender os embriões por pipetagem suave e transferir as amostras de 25 ul de embriões em uma lâmina de vidro, em seguida, colocar uma lamela sobre os embriões e vedação sobre a lâmina com unha polonês. </li><li> Analisar amostras de embriões, utilizando um microscópio de fluorescência. </li></ol>

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Para as etapas de síntese da sonda, que normalmente geram o escoamento sondas antisense RNA por transcrição in vitro a partir de cDNAs completos Drosophila amplificados de plasmídeos encontrados no gene Drosophila Collection (DGC), um recurso detalhada no site: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Esta abordagem tem sido amplamente utilizado em estudos de grande escala ISH destinadas a ex...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> T7, T3 ou SP6 RNA polimerase </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Kits contêm tampão de reacção. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de sódio 3M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% frio. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 70% frio. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução de lixívia de cloro diluído 1:1 com água. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, Ontário, Canadá </td><td> Catalog No. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de formaldeído a 40%, recentemente preparada </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% de Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina solução </td><td></td><td> 2 mg / ml de glicina em PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 de uma diluição de 1 mg / ml de solução concentrada de PBTB </td></tr><tr><td> HRP-conjugado ovelha monoclonal anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 diluição da solução de reserva em PBTB </td></tr><tr><td> A biotina conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 de uma diluição de 1 mg / ml de solução concentrada de PBTB </td></tr><tr><td> Estreptavidina-HRP conjugado </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, EUA </td><td> S991 </td><td> (Diluição 1/100 de um estoque 1 ug / ml </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Avaliar o padrão de expressão de um gene, assim como as propriedades de localização subcelular dos seus transcritos de ARN, são características chave para a compreensão da sua função biológica durante o desenvolvimento. RNA de hibridação in situ (RNA-ISH) é um poderoso método utilizado para visualização de propriedades de distribuição de RNA, seja nos organismos, níveis celulares ou subcelular 1. RNA-ISH baseia-se na hibridação de uma sonda marcada de ácido nucleico (por exemplo, ARN anti-sentido, oligonucleótidos) complementar à sequência de um mRNA ou de um não-codificantes de ARN alvo de interesse 2. À medida que o processo requer a informação de sequência primária sozinho para gerar sondas específicas de sequência, pode ser universalmente aplicado a uma ampla gama de organismos e amostras de tecido 3. De facto, uma série de estudos de grande escala ISH foram implementados para documentar a expressão do gene de ARN e dinâmica de localização em vários organismos modelo, o que levou àestabelecimento de recursos comunitários importantes 4-11. Embora uma variedade de etiquetagem da sonda e estratégias de detecção têm sido desenvolvidos ao longo dos anos, o uso combinado de reagentes de detecção marcados por fluorescência e as etapas de amplificação enzimática de sinal oferecem melhorias significativas na sensibilidade e resolução do processo 12. Aqui, nós descrevemos um método fluorescente optimizado em hibridização in situ (FISH) utilizando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para visualizar a expressão de RNA e da dinâmica de localização em embriões de Drosophila faseados. O procedimento é realizado em formato de 96 poços da placa de PCR, o que facilita grandemente o processamento simultâneo de um grande número de amostras.

Quando realizada com sucesso, este procedimento oferece um nível notavelmente melhorada de detalhe na análise espaço-temporal da expressão gênica e dinâmica de localização de mRNA durante a embriogênese Drosophila cedo. De fato, como ilustrado na Figura 3A para o nanico gene clássico par-regra (pista), pode-se usar este protocolo para observar eventos de expressão gênica por meio da detecção de focos transcrição nascente em grupos de núcleos expressando. Além...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Aqui nós descrevemos um fluorescente todo-mount<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridização (FISH) para determinar as propriedades de expressão e localização de RNAs expressas durante a embriogênese na mosca da fruta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K visualizações.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Aqui nós descrevemos um fluorescente todo-mount In situ Protocolo de hibridização (FISH) para determinar as propriedades de expressão e localização de RNAs expressas durante a embriogênese na mosca da fruta, Drosophila melanogaster.

Vídeo: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...