Damos las gracias a J. J. Qiu cappellani y de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional del Cáncer (U01 CA141451), el Consorcio de Cáncer Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Caminata Día de Lucha contra el Cáncer de Mama, Manhasset Coalición de Mujeres contra el Cáncer de Mama para mí, y una pre-doctoral de becas del Programa de Investigación del Cáncer de mama Dirigida el Congreso, a ESNESN EE.UU. es también el destinatario de la rápida Leslie C. y William Randolph Hearst Becas de la Fundación de la Escuela Watson de Ciencias Biológicas. HAA fue apoyado por fondos del Consejo de Investigación de Noruega (160698/V40 y 151.882) y del Sureste Autoridades Regionales de Salud (2007060).

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados IACUC.

Las respuestas de los tumores a terapias sistémicas in vivo puede ser drásticamente diferente a las de las células cancerosas in vitro, como el microambiente influye tanto en la respuesta aguda y la recaída 5. Uno de los mayores obstáculos para la explicación de quimio-resistencia en las vías in vivo es la complejidad de las interacciones entre las células cancerosas y su microentorno. En particular, porque los tumores sólidos han desarrollado un equilibrio entre el cáncer y las células estromales, las perturbaciones de un componente, tales como la muerte celular que se produce durante el tratamiento contra el cáncer, puede resultar en efectos dramáticos en la organización del tejido. La técnica de imagen intravital proporcionado aquí permite la visualización directa de cáncer de estroma de células interacciones dentro de los tumores de los ratones vivos, anestesiados durante el tratamiento con fármacos contra el cáncer. Utilizamos microscopía confocal disco giratorio, que tiene una profundidad de penetración relativa limitada (ver 17 </sup&gt;), pero nuestras técnicas quirúrgicas y el etiquetado puede ser utilizado con otros tipos de microscopía. Películas adquiridos a partir de estos experimentos se puede utilizar para el seguimiento de procesos que incluyen cambios en la intensidad de fluorescencia (por ejemplo, debido a la infiltración de una población marcada o la inducción de la muerte celular), la motilidad celular, la distribución de inyectables (por ejemplo, para el seguimiento de la pérdida vascular), y co- localización de las señales fluorescentes 5,12,17,20. En forma rutinaria ratones de imagen para más de 6 horas y las imágenes también se realizó hace más de 18 horas. Esto requiere el mantenimiento de los ratones continuamente bajo anestesia para estos períodos de tiempo largos. Con la anestesia adecuada, más del 90% de los animales a sobrevivir 6 horas, y aproximadamente el 80% sobrevive más de 18 horas. Los detalles sobre cómo llevar a cabo a largo plazo anestesia se han publicado previamente 19. En nuestra experiencia, los cinco factores son fundamentales: evitar la hipotermia, evitando la deshidratación, el mantenimiento de los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno en sangre, ucantar gas portador humidificado para el isoflurano, y de mantenimiento de los animales en el nivel más bajo de la anestesia en los que no muestran signos de dolor. Para mantener la temperatura corporal, es mantener a los ratones bajo una manta calentada (a 38 ° C). Para evitar la deshidratación, se inyectan pequeños volúmenes de solución salina intraperitoneal a lo largo de todo el procedimiento de imagen. Para mantener los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno en sangre, se comienza con 21% de oxígeno en el gas portador (en lugar de los de uso común 100%). Esto nos permite aumentar los niveles de oxígeno inhalado si un ratón - horas en un experimento - muestra una disminución en la saturación de oxígeno en sangre. En nuestra experiencia, el aumento de los niveles de oxígeno inhalado en ese momento (por ejemplo, 30-40%) casi siempre se estabilizará el animal lo que permite horas de imágenes adicionales. El nivel óptimo de anestesia es para la mayoría de los ratones obtenidos con isoflurano 1-1.5% y los resultados de las tasas de respiración de 60-65/min y frecuencias de pulso de 400-450/min. En nuestros experimentos de imagen, usamos principalmente modelo de ratón transgénicos (MMTV-PYMT y C3 [1]-Tag) en el que los tumores son multifocales, permitiendo la obtención de imágenes de lesiones múltiples en diferentes etapas de la progresión tumoral en paralelo en múltiples x, posiciones en Y durante una sola sesión de imagen. Esto disminuye preocupaciones con respecto ratón-a-ratón de variación con respecto a los experimentos dirigidos a la identificación de fase dependientes de respuestas terapéuticas, y reduce el número de animales necesarios para la formación de imágenes. El modelo MMTV-PYMT (y otros modelos de cáncer espontáneo) pasan por etapas progresivas histopatológicos que pueden ser reconocidos durante la exploración intravital, a pesar de la puesta en escena patológica de las lesiones tumorales que se pueden realizar durante la exploración intravital es diferente y menos detallada que la de secciones histológicas 5,17. En contraste, los modelos de trasplante tienden a reflejar los tumores de etapa tardía mejor, como las células cancerosas generalmente están aislados de tumores avanzados. Tales modelos son por lo tanto más susceptibles a estudiar tumor-estromainteracciones de los tumores en estadios tardíos que diferencias en las interacciones entre las diferentes fases. Nos muestran ejemplos de cómo reproducir nucleares cambios estructurales que ocurren después de la muerte celular inducida por la terapia. En ausencia de tratamiento contra el cáncer, esta estrategia de etiquetado en lugar se puede utilizar para la división de la imagen celular in situ, elucidar, por ejemplo, cómo la proliferación celular y la latencia está influenciado por el microentorno. En el futuro, el marcaje fluorescente de los componentes mitocondriales pueden hacer posible cambios de imagen mitocondriales que se producen durante la muerte celular apoptótica. En este protocolo, también hemos demostrado ejemplos de cómo las interacciones de imágenes de células de cáncer de células inmunes después de la terapia, pero otros componentes microambientales también se pueden visualizar y formado la imagen. Existentes líneas transgénicas reportero para los componentes del estroma se encuentran las de los fibroblastos (por ej., FSP1-EGFP 17 de αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) o las células de la vasculatura (por ejemplo, Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital de imágenes permite la visualización en tiempo real de las interacciones y los procesos que se producen en la administración in vivo después de la quimioterapia. Con la tecnología disponible en la actualidad, se han logrado importantes avances en la comprensión de cómo las células mieloides influyen en la respuesta terapéutica, sin embargo, debido a que el microambiente tumoral es tan complejo, los avances más importantes siguen siendo necesarios para empezar a profundizar de manera mecánica en los procesos que subyacen entorno mediado resistencia a los medicamentos. Uno de los avances más importantes que aún se requieren es la identificación de mejores marcadores de poblaciones celulares específicas. La importancia de los mejores marcadores está bien ilustrado con dos de los componentes celulares más prominentes del estroma del microambiente del tumor de mama, fibroblastos y células inmunes. α-actina de músculo liso (αSMA) se utiliza frecuentemente para identificarfibroblastos, pero la proteína se expresa también por células musculares lisas vasculares y células mioepiteliales 24. Así, aunque αSMA-GFP reportero ratones existen, para determinar el tipo específico de célula es lo siguiente durante un experimento de imagen intravital es un reto. Del mismo modo, un único marcador fluorescente tal como EGFP expresa bajo el promotor c-fms menudo identificar subpoblaciones múltiples de células inmunes 12,17. Así, aunque, idealmente, le gustaría utilizar un solo marcador para identificar un tipo celular específico de la complejidad de la biología subyacente plantea un desafío importante en el uso de este enfoque. Una solución parcial a este problema es usar etiquetas inyectables para diferenciar las subpoblaciones de células que expresan el reportero fluorescente mismo. Por ejemplo, dextranos fluorescentes son captados por los macrófagos y se puede utilizar para etiquetar las subpoblaciones de macrófagos que están marcados por el c-fms-EGFP y FSP1-EGFP reportero ratones transgénicos <sup&gt; 17. Los anticuerpos conjugados con sondas fluorescentes también se han utilizado para identificar subpoblaciones específicas (por ejemplo, la población Gr1-positivo de las células mieloides marcadas por el reportero c-fms-EGFP 17). A diferencia de las curvas de respuesta de tumor generados por el calibrador de medición, que proporcionan poca información mecanicista sobre cómo o por qué los tumores responden a la terapéutica administrada, o una serie histológico derivadas de tejidos cosechados en diferentes puntos temporales que requieren grandes cohortes de animales, nuestra técnica proporciona información directa, cuantificable en la dinámica de la muerte de la célula y en las interacciones de células estromales con células cancerosas en cohortes pequeñas. Por lo tanto, la ventaja de utilizar la técnica aquí es que proporciona información dinámica sobre las respuestas de drogas en el contexto de un microambiente tumoral intacta en tiempo real. Dicha información puede conducir a importantes conocimientos sobre los procesos subyacentes que impulsan las respuestas terapéuticas 5 &lt;/ Sup&gt;.

Los tumores sólidos están compuestos de dos compartimentos principales: las células cancerosas y los componentes del estroma (tanto celulares y no celulares-) que ayudan en el mantenimiento de un ambiente adecuado para el crecimiento del tumor 1. Estos componentes del estroma desempeñan papeles críticos en el desarrollo, progresión y metástasis de muchos tipos de cánceres, incluyendo los de la mama 2-5. El medio estromal también influye en las respuestas terapéuticas 2,4,5. Por lo tanto, la determinación de cómo las células cancerosas responden a las terapias convencionales y nuevas en el contexto de la microambiente intacta es importante para avanzar en nuestro entendimiento de la biología del cáncer y la mejora de estrategias terapéuticas actuales. Por otra parte, la definición de cómo el cáncer de células del estroma interacciones cambiar después de la administración de la terapia es fundamental para la comprensión de la biología de la recidiva tumoral. Organotípicos co-cultivo de los sistemas han sido útiles para el estudio de las interacciones tumor-estroma <shasta&gt; 6, pero es evidente que los métodos actualmente disponibles no con éxito puede recapitular el microambiente del tumor intacto in vitro, en particular con respecto a la función vascular y reclutamiento de células inmunes. De hecho, las respuestas celulares de cáncer a las terapias que se observan in vitro a menudo son significativamente diferentes de los observados in vivo, donde el microambiente está intacta 5. Así, en modelos in vivo para el estudio de tumores del estroma interacciones y su impacto en la respuesta terapéutica puede reflejar mejor los mecanismos de relevancia clínica 7. Los medios principales de estudio de las respuestas a la terapia contra el cáncer in vivo han sido a través de mediciones del tamaño del tumor y la evaluación histológica de tejidos derivados de animales tratados o pacientes. Sin embargo, los avances en microscopía fluorescente y periodistas en las últimas dos décadas han permitido la visualización de los procesos inter e intracelularAlta resolución de animales vivos, anestesiados (intravital de imágenes) 8. Estas tecnologías de microscopía intravital han demostrado ser especialmente valioso para espacial y temporalmente en la disección de la dinámica in vivo de tumor-estroma interacciones en resolución celular y subcelular 8,9. Los procesos que se han descifrado por formación de imágenes intravital incluyen anti-tumor citotoxicidad de las células T 10,11, interacciones entre las células T y las células mieloides 12, la dinámica de los cambios en la composición y la organización de colágeno después del tratamiento terapéutico 13, macrófagos dependiente de la intravasación de células cancerosas y metástasis 14, y la permeabilidad vascular 15. Existen tres requerimientos principales para la formación de imágenes intravital. Estos incluyen la adecuada preparación y exposición de los tejidos de formación de imágenes, el marcaje fluorescente de los componentes del tejido de interés, y una s-cámara emparejado microscopíaistema capaz de adquirir imágenes 16. Las estrategias más comunes que se utilizan para hacer frente a estos requisitos incluyen: 1) los preparativos heterotópicas (por ejemplo, la inoculación de la oreja o el ojo orbital), permanente de imágenes de Windows, o preparaciones exteriorizadas (por ejemplo, la aleta dorsal piel), 2) los transgénicos fluorescentes y reporteros.. inyectables fluorescentes para etiquetar los componentes del tejido, y 3) los sistemas de microscopía confocal o multifotón emparejado con tubos fotomultiplicadores o dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) cámaras, respectivamente 9. Se utilizó un modelo de colgajo de piel quirúrgicamente preparado para exponer la glándula mamaria inguinal para imágenes en los animales anestesiados que expresan transgenes que codifican los reporteros fluorescentes. Las imágenes se obtuvieron durante un período de 12 a 40 horas, usando un CCD intensificada (ICCD) de la cámara se combina con un sistema láser de cuatro hilado disco microscopio confocal 17. Imágenes de esta manera nos ha permitido estudiar procesos como la distribución de drogas en vivo, dependiente de la etapa chrespuestas emotherapeutic, tipo de muerte celular inducida por la quimioterapia, y el comportamiento celular mieloide 5. Proporcionamos un protocolo para la formación de imágenes intravital de respuestas celulares de cáncer a la terapia anti-cáncer y tumor-estroma interacciones en modelos de ratón de cáncer de mama. Este protocolo se puede utilizar para realizar un seguimiento de los comportamientos y la muerte de las células cancerosas y las componentes del estroma con una amplia variedad de marcadores fluorescentes transgénicos e inyectables, tanto en modelos transgénicos y trasplante durante periodos de hasta 40 horas en una sola sesión de imágenes.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> MMTV-PYMT ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Hecho en casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD dextrano, conjugados con fluoresceína </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstituir en dH 2 O (4 mg / ml, almacenar a -20 ° C); diluido a 1 mg / ml en 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD dextrano, Alexa Fluor 647-conjugado </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstituir en dH 2 O (4 mg / ml, almacenar a -20 ° C); diluido a 1 mg / ml en 1 x PBS </td></tr><tr><td> Clorhidrato de doxorubicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstituir en dH 2 O y se almacena a 4 º C, se diluye en 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurano) </td><td> Mayordomo Animal Health Supply </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> De yoduro de propidio </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; diluido 1:15 en 1 x PBS </td></tr><tr><td> Nitrógeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxígeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;aguja de bisel normal </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Software de código abierto </td></tr><tr><td> Alcohol hisopo </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> Isopropílico al 70% torundas con alcohol </td></tr><tr><td> Anestesia sistema </td><td> Productos Molecular Imaging Co., </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubierta de vidrio </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, 24x50 mm; desinfectar con toallitas isopropanol al 70% </td></tr><tr><td> Esponjas de gasa Curity (estériles) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Limpieza previa, y si no previamente limpiada, desinfectar con toallitas isopropanol al 70% </td></tr><tr><td> Templados tijeras finas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14090-11 </td><td> 2 pares, el acero inoxidable, afilado afilados como puntas, punta recta, de 26 años de vanguardia mm, 11 cm de longitud </td></tr><tr><td> Manta climatizada </td><td> Industrias Gaymar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot talón esterilizador </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 18000-45 </td><td> Girar en aproximadamente 30 min antes de su uso; esterilizar los instrumentos a&gt; 200 ° C durante 30 sec </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Productos de Elmer </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta Laboratory (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio de cinta (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tapa paraun enfriador de poliestireno envío </td><td></td><td></td><td> Esto será utilizado como la plataforma quirúrgica </td></tr><tr><td> Micro pinzas de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 dientes, curva leve, 0,8 mm de ancho, punta de 4 &quot;de longitud </td></tr><tr><td> Micro pinzas de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dentado, ligera curva, 0,8 mm anchura de la punta, 4 &quot;de longitud </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td></td><td></td><td> Spinning disco confocal, XYZ etapa Piezo, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Microscopio inserción etapa </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td></td><td> Fabricado a medida, con dos puertos de imágenes circulares </td></tr><tr><td> MouseOx oxímetro, software, y sensores </td><td> STARR Ciencias de la Vida </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene de Super Versi-Dry laboratorio soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Cortar en cuartos para el revestimiento de plataforma quirúrgica </td></tr><tr><td> Nebulizador </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Se utiliza para humidificar gases, previene la irritación de los tejidos pulmonares </td></tr><tr><td> Slip-punta desechable jeringa de tuberculina (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> SurFlo alado equipo de infusión </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;aguja ultra delgado de 12&quot; tubos </td></tr><tr><td> Betadine spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

El microambiente tumoral juega un papel fundamental en la iniciación del tumor, progresión, metástasis, y la respuesta a terapias contra el cáncer. Tridimensionales de co-cultivo sistemas se utilizan con frecuencia para explicar las interacciones tumor-estroma, incluyendo su papel en las respuestas de drogas. Sin embargo, muchas de las interacciones que se producen in vivo en el microambiente intacto no puede ser completamente replicado en estos ajustes en in vitro. Por lo tanto, la visualización directa de estos procesos en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante en la comprensión de las respuestas a las terapias tumorales y la identificación de las interacciones entre las células cancerosas y el estroma que puede influir en estas respuestas. Aquí se proporciona un método para el uso de la microscopía confocal de disco giratorio de ratones vivos, anestesiados para observar directamente de distribución de fármacos, las respuestas de células cancerosas y los cambios en las interacciones tumor-estroma después de la administración de la terapia sistémica en modelos de cáncer de mama. Se describen procedimientos para labeling componentes diferentes de tumores, el tratamiento de los animales para la observación de las respuestas terapéuticas y el procedimiento quirúrgico para exponer los tejidos tumorales para imágenes de hasta 40 horas. Los resultados obtenidos de este protocolo son películas a intervalos, en los que los procesos tales como infiltración de droga, la muerte celular del cáncer y la migración de células del estroma pueden ser evaluados utilizando software de análisis de imagen.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el cáncer<em&gt; In vivo</em&gt; Y en resolución única célula.

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

live-imaging-drug-responses-tumor-microenvironment-mouse-models

Research

JoVE Journal

Medicine

24.6K vistas.  Watson School of Biological Sciences. Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el cáncer In vivo Y en resolución única célula.

Video: Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelos de 4D Live de células de imagen de un tumor: Interacciones microambiente que la progresión maligna del impacto

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodal de imágenes de la angiogénesis en un modelo de rata desnuda de las metástasis óseas del cáncer de pecho utilizando imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada y la ecografía volumétrica

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Los fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...