Utilizando esta sofisticada herramienta no invasiva, podemos monitorear en tiempo real la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica en ratones, lo que tiene un gran potencial en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de la enfermedad. La combinación de luciferasa y detección de fluorescencia es una estrategia útil para avanzar en los estudios preclínicos de progresión del cáncer de mama y manejo de la enfermedad. Esto se puede aplicar para estudios de medicamentos contra el cáncer.
Este protocolo no se limita al cáncer de mama y podría aplicarse a otros carcinomas, como el de pulmón y de páncreas. Comience por cultivar las células MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231 GFP y luciferasa positivas por separado en una placa de 16 centímetros al 80% de confluencia. Después de cosechar las células por tripsinización, sembra un número creciente de células en cada pozo en una placa negra de 96 pocillos.
Luego, llene todos los pozos con 100 microlitros de DMEM e incube durante 16 a 24 horas en una incubadora de 37 grados Celsius, 5% co2. Prepare la solución de luciferina en PBS a una concentración de 1.5 miligramos por mililitro y almacene la solución a menos 20 grados Celsius. Después de la incubación, lave las células una vez con PBS suavemente antes de agregar 100 microlitros de solución de luciferina en cada pozo.
Espere dos minutos y luego mida la actividad de la luciferasa en todas las células de cáncer de mama utilizando bioluminiscencia. Antes de inyectar el ratón, transfiera cinco millones de células MCF-7 y MDA-MB-468 en 200 microlitros de PBS y dos millones de células MDA-MB-231 GFP y luciferasa positivas a 100 microlitros PBS. Prepare el ratón anestesiado para la inyección colocando un cono sobre la cabeza en posición supina.
A continuación, limpie el área abdominal del ratón por encima de la glándula mamaria con etanol con un hisopo de algodón y levante la cuarta glándula mamaria con fórceps antes de insertar una aguja de calibre 27 debajo de la almohadilla de grasa para inyectar lentamente 100 microlitros de la suspensión celular preparada. Después de la inyección, saque el ratón de la capucha y transfiéralo a una nueva jaula bajo observación hasta que vuelva a la conciencia. Antes de la detección de bioluminiscencia, sujete al ratón consciente sosteniendo su cuello con la mano izquierda e inclinando la mano hacia la izquierda, lo que resulta en la cara del ratón hacia arriba con la parte inferior del cuerpo en posición supina.
Inyecte 100 microlitros de luciferina de 30 miligramos por mililitro por vía intraperitoneal en el cuadrante abdominal inferior izquierdo del ratón con una jeringa de un mililitro. Mantenga al ratón durante siete minutos sin anestesia, seguido de tres minutos dentro de la cámara de anestesia antes de medir la cinética del tumor. Mientras el ratón está en incubación, abra el software e inicialice el sistema de imágenes haciendo clic en el botón Inicializar.
Mantenga la configuración en exposición automática con el tiempo de exposición en el auto a 60 segundos, el medio de agrupación en una apertura de f / stop uno, el filtro de excitación bloqueado y el filtro de emisión abierto. Cuando finalice la inicialización, seleccione Asistente para imágenes y Bioluminiscencia y, a continuación, haga clic en Siguiente, Abrir filtro para seleccionar el mouse en el asunto de la imagen. En la vista de campo, seleccione la etapa C a 10 centímetros y la altura del sujeto a 1,50 centímetros.
A continuación, haga clic en Etapa de configuración de imagen para C.Asegúrese de que el mouse esté colocado en el escenario en la posición supina adecuada antes de cerrar la puerta y hacer clic en el botón Adquirir. Espere a que aparezca una imagen en la pantalla. Repita el procedimiento para el otro ratón.
Para detectar metástasis pulmonares, cubra la señal fuerte del tumor primario con un papel de cartón grueso y exponga solo el lado ventral de los pulmones hacia la cámara. Capture la imagen utilizando los mismos parámetros descritos anteriormente. Las líneas celulares de cáncer de mama estaban infectadas con un vector de lentivirus que expresaba GFP fluorescente y estaban sujetas a clasificación FAC.
Las células GFP positivas se clasificaron dos días después de la infección, se enchaparon y se visualizaron mediante microscopio de fluorescencia. La actividad de la luciferasa in vitro se confirmó con un aumento dependiente del número celular en los niveles de actividad de la luciferasa. Además, se encontró una correlación lineal entre la actividad de la luciferasa y el número de células.
Después de inyectar las líneas celulares de cáncer de mama, los ratones fueron sometidos a lectura de bioluminiscencia cada dos semanas para determinar la cinética de crecimiento tumoral. La cinética de crecimiento tumoral fue más rápida en las líneas celulares MDA-MB-231 que en las líneas celulares menos agresivas, MCF-7 y MDA-MB-468. La actividad de luminiscencia se cuantificó para tres líneas celulares.
Seis semanas después de la inyección, se encontró que los tumores cosechados mantenían la expresión de GFP. Además, se obtuvieron lecturas positivas de bioluminiscencia del pulmón de todo el ratón en tiempo real. El pulmón se recolectó para verificar colonias metastásicas positivas, y las colonias metastásicas se observaron para GFP y bioluminiscencia.
Es más importante tener cuidado al realizar el procedimiento de inyección. Una inyección inadecuada puede conducir a una desviación en la tasa de crecimiento del tumor o a la ausencia de tumor. Podemos examinar la metástasis pulmonar in vivo y ex vivo mediante la detección de la expresión de GFP.
Además, también podemos estudiar la histopatología de los pulmones mediante tinción basada en inmunohistoquímica. Esta técnica puede ser útil para explorar las nuevas preguntas, como el efecto de los estudios de eficacia de fármacos.
